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糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症,也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病肾病可以累及肾组织多种结构。病变早期表现为肾小球、肾小管肥大,基膜增厚等,病变继续发展,可出现肾小球系膜区大量细胞外基质的沉积,弥漫或结节性肾小球硬化,小管萎缩,间质纤维化等。
转化生长因子β(TGF-β)具有促进细胞外基质聚集和促纤维化作用。TGF-β可刺激细胞外基质分子合成,包括Ⅰ型胶原,Ⅳ型胶原,纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白。TGF-β可抑制蛋白酶,激活蛋白酶抑制物(如纤溶酶原激活剂抑制物,PAI-1)来减少基质的降解。TGF—β还可上调整合素来促进细胞一基质问的相互作用,增加细胞外基质的聚集性。TGF-β在糖尿病肾病的发病机制中占有重要地位。动物试验证明,糖尿病肾病的进行性发展主要是由于肾内TGF-β系统活性增强所致。在糖尿病肾损害中,几乎所有已证实的分子介质和细胞内传导途径都可刺激、介导肾内TGF-β的活化。因此,医学界一直在探寻着通过拮抗TGF-β来治疗糖尿病肾病的新方法。
我们以往的工作证实,大黄酸能明显抑制由TGF—β1诱导的系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达和细胞糖摄入,逆转由细胞糖代谢异常所致细胞肥大和细胞外基质的产生；能够通过影响细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)活性,抑制TGF-β1诱导的内皮细胞PAI—1 mRNA表达和蛋白质合成,从而对内皮细胞有显著的保护作用。大黄酸还能抑制糖尿病状态下的肾小管细胞肥大和细胞外基质产生,减轻糖尿病肾病的病变。因此,大黄酸可能通过纠正细胞糖代谢紊乱,拮抗TGF-β1的作用,保护内皮细胞功能和逆转胰岛素抵抗作用在糖尿病及糖尿病肾病的治疗中发挥作用。
实验证实,冬虫夏草(cordyceps sinensis,简称虫草)有提高机体免疫功能,降血脂,耐缺氧,对缺血性肾毒性损伤有保护作用,促进肾小管上皮细胞修复及肾功能的恢复,延缓慢性肾功能不全患者的肾功能衰退。在环孢霉素A(CsA)肾毒性和UUO间质性肾炎动物实验研究中发现,虫草可以防治肾组织的慢性纤维化,与此同时组织中的TGF-β表达减少。由于天然虫草产量有限,虽然其临床效果很明显,但并不能得到广泛应用。国内采用人工培养真菌菌种发酵而得到的人工虫草,与天然虫草有相似的化学成份、药理作用。在肾移植术后患者中应用人工虫草,可以拮抗因使用免疫抑制剂CsA所引起的肾脏损害。在对人工虫草及其提取物对CsA引起的肾毒性保护作用的实验过程中发现,人工虫草具有抑制TGF—β的效果。
本研究从动物实验部分探讨大黄酸和人工虫草在糖尿病肾病中对肾组织TGF-β1及其受体的影响,探讨大黄酸和人工虫草治疗糖尿病肾病的作用机制。
本研究由两部分组成:
研究一：大黄酸对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子-β1及其受体表达的影响
目的:探讨大黄酸对STZ糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型(TβRⅠ)、Ⅱ型受体(TβRⅡ)的影响及其可能作用机理。
方法:采用STZ腹腔注射法建立糖尿病动物模型。96只3月龄雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组,糖尿病模型对照组,低剂量大黄酸治疗组(35mg／(kg·d))和高剂量大黄酸治疗组(70mg／(kg·d))。第4、8、12周各组处死8只大鼠并收集标本,记录体重、左肾重,检测血糖、血肌酐、血脂、24h尿蛋白排泄量,ELISA法检测24h尿TGF-β1水平。PAS染色分析肾小球病理形态学改变。RT-PCR法、Western blot法及免疫组化法检测肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、纤维连接蛋白(FN)及葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)mRNA及蛋白质表达水平。
结果:糖尿病模型大鼠血糖及24h尿蛋白排泄量明显增高,组织学显示肾小球肥大,系膜区扩张,呈现出典型的DN表现。肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及FN mRNA表达水平在12周内表现进行性升高,肾组织GLUT1 mRNA水平在12周内表现为先下调,后上调的趋势。而肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、FN及GLUT1蛋白质表达水平均在8周时达到高峰值,12周时表现下降。大黄酸治疗可降低糖尿病大鼠血糖、血脂及血肌酐水平,减少24h尿蛋白及尿TGF—β1排泄量,肾重指数下降。大黄酸治疗可明显改善DN大鼠肾脏病理改变(肾小球和系膜区面积减少)。大黄酸治疗还可时间-剂量依赖性下调糖尿病大鼠肾组织TGF—β1、TβRⅠ、TβRⅡ、FN及GLUT1mRNA及蛋白质的表达水平。
结论:大黄酸可通过降低糖尿病大鼠血糖水平,一方面直接减少TGF-β1的合成,另一方面通过抑制己糖胺通路异常活化,抑制GLUT1的产生及其功能活性,减少TGF-β1的产生,从而下调TβRⅠ、TβRⅡ表达,降低肾内TGF—β系统活性,延缓糖尿病肾病的发展。
研究二：人工冬虫夏草对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子-β1及其受体表达的影响
目的:探讨人工冬虫夏草(虫草)对STZ糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型(TβRⅠ)、Ⅱ型受体(TβRⅡ)的影响及其可能作用机理。
方法:采用STZ腹腔注射法建立糖尿病动物模型。96只3月龄雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组,糖尿病模型对照组,人工虫草低剂量治疗组(5g／kg·d))、中剂量治疗组(10g／(kg·d))和高剂量治疗组(20g／(kg·d))。第4、8、12周各组处死6只大鼠并收集标本,记录体重、左肾重,检测血糖、血肌酐、24h尿蛋白排泄量,ELISA法检测24h尿TGF-β1水平。PAS染色分析肾小球病理形态学改变。RT-PCR法、Western blot法及免疫组化法检测。肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及FN mRNA及蛋白质表达水平。
结果:糖尿病模型大鼠血糖及24h尿蛋白排泄量明显增高,组织学显示肾小球肥大,系膜区扩张,呈现出典型的DN表现。肾组织TGF-β1 mRNA和蛋白质表达以及TβRⅠ、TβRⅡ和FN mRNA表达均在8周时达到高峰值,12周时表现下降；TβRⅠ、TβRⅡ及FN蛋白质表达在12周内表现进行性升高。人工虫草治疗可时间-剂量依赖性降低糖尿病大鼠24h尿蛋白及尿TGF-β1排泄量,血肌酐水平下降,肾重指数下降。人工虫草治疗可明显改善DN大鼠肾脏病理改变(肾小球和系膜区面积减少)。人工虫草治疗可下调糖尿病大鼠肾组织TGF—β1、TβRⅠ、TβRⅡ及FN mRNA及蛋白质的表达水平。
结论:人工虫草可减少TGF-β1的产生,下调TβRⅠ、TβRⅡ表达,降低肾内TGF-β系统活性,延缓糖尿病肾病的发展。
本研究结果表明:
1、大黄酸对STZ诱导糖尿病模型大鼠的肾脏病变疗效显著,它可有效的降低血糖,改善脂质代谢紊乱,降低血肌酐,减少蛋白尿,减少尿TGF—β1排泄量,减轻肾小球细胞外基质的积聚。大黄酸在mRNA和蛋白质水平上对肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、FN及GLUT1均起下调作用。其机制可能是通过降低糖尿病大鼠血糖水平,一方面直接减少TGF—β1的合成,另一方面通过抑制己糖胺通路异常活化,抑制GLUT1的产生及其功能活性,减少TGF-β1的产生,从而下调TβRⅠ、TβRⅡ表达,降低肾内TGF—β系统活性,延缓糖尿病肾病的发展。
2、人工虫草对STZ诱导糖尿病模型大鼠的肾脏病变同样具有疗效。它可降低血肌酐,减少蛋白尿,减少尿TGF—β1排泄量,减轻肾小球细胞外基质的积聚,但对血糖及脂质代谢无明显影响。人工虫草在mRNA和蛋白质水平上对肾组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及FN均起下调作用。人工虫草延缓糖尿病肾病的发展的机制可能与直接减少TGF-β1的产生,下调TβRⅠ、TβRⅡ表达,降低肾内TGF-β系统活性有关。