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目的:鬼臼毒素(podophyllotoxin)是由中草药中分离提取的具有抗肿瘤活性的有效成分,对肿瘤细胞具有抑制作用。但其水溶性差、抗瘤谱窄和较为严重的骨髓抑制作用限制了其广泛应用,而经过了一系列改造过程形成的鬼臼毒素新衍生物ZM-10可减少其毒副作用。本实验通过研究ZM-10作用下KB细胞的形态学改变、生长状况等指标,探讨其对于口腔鳞状细胞癌的应用前景。
材料和方法:
1.实验材料:口腔鳞状细胞癌KB细胞株2 实验方法;口腔鳞状细胞细胞癌KB细胞接种于含10%胎牛血清,100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中,将培养瓶置于37℃、5%C02饱和湿度培养箱培养,每1~2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时,用0.25%胰蛋白酶消化,传代。MTT法检测ZM-10的抗癌活性,确定其对KB细胞的半数生长抑制浓度后进行促凋亡机制的研究,各实验均分为四组:A组(0.1%DMSO处理24小时),B组(1.5graol/L ZMm-10处理24小时),C组(3μmol/L ZM-10处理24小时),D组(6gmol/LZM-10处理24小时),应用倒置光显微镜、荧光显微镜观察细胞形态结构改变;应用琼脂糖凝胶电泳分析ZM-10对KB细胞染色体DNA断裂的影响;应用流式细胞术分析ZM-10对KB细胞周期的影响和诱导凋亡率的变化;应用RT-PCR法检测各组细胞P53、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达的变化。结果:
1.MTT法发现ZM-10对口腔鳞状细胞癌KB细胞株的半数抑制浓度(IC50)为3μmol/L。通过观察对KB细胞生长曲线的影响,发现在不同浓度的ZM-10作用下,能显著抑制KB细胞的增殖,并具有量效关系。
2.流式细胞仪检测B、C、D三个实验组均有特征性的凋亡峰形成。对照组A组凋亡率为15.5±1.53%,实验组B组凋亡率为18.6±3.8%,C组凋亡率为25.6±2.87%,D组凋亡率为37.2±4.5%,加药各组(B、C、D组)的凋亡率与对照组A组相比有显著性差异(p<0.05)。且结果显示与空白对照组相比ZM-10可在抑制细胞各时相的同时,使细胞周期阻断在G2+M期。
3.ZM-10处理KB细胞后细胞形态的改变.荧光显微镜下观察可发现KB细胞凋亡的形态学变化,细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,并且随着ZM-10浓度的加大,镜下这种细胞形态的变化愈来愈明显,表明凋亡细胞的比例逐渐增加,具有剂量依赖性。
4 在经典的DNA降解断裂检测实验中,抽提B、C、D组富集小分子量DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯子”(DNA ladder)与A组形成明显对照,表明ZM-10诱导KB细胞发生凋亡。
5 通过流式细胞仪对细胞的DNA含量进行测定,可见B、C、D组于正常G0/G1细胞群前出现DNA低染细胞群,称为“A0细胞群”或“亚G1细胞群,Sub-G1”即凋亡细胞群,该现象被认为是细胞发生凋亡的标志之一,且凋亡细胞的比例随着ZM-10浓度的升高而增大,呈一定的剂量依赖性。综上结果可以认为ZM-10能够诱导肿瘤细胞的凋亡。 6 ZM-10对KB细胞凋亡相关基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响。RT-PCR结果显示B、C、D细胞中P53,Caspase-3和Bax的mRNA的表达升高,同时降低了Bcl-2的mRNA的表达,同对照组A组相比均有显著性差异。提示ZM-10诱导肿瘤细胞凋亡的作用是依靠上调了Caspase-3,p53和Bax mRNA的表达,同时协同下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。
结论: (1)ZM-10可诱导KB细胞发生凋亡。(2)不同同浓度ZM-10作用于KB细胞,使细胞周期发生改变,并且可将肿瘤细胞阻断在G2+M期。(3)不同同浓度ZM-10作用于KB细胞,影响肿瘤细胞内相关癌基因及抑癌基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表达。(4)ZM-10有望为口腔鳞癌临床治疗提供新的思路。