生物体中的生物活性寡糖很少单独存在，它们大多与另一种或几种糖缀合物结合在一起，比如在细胞表面的糖蛋白和糖脂。在糖缀合物中，其糖链的功能多种多样，近年来的研究表明，糖链作为信息分子，涉及多细胞生命的全部空间和时间过程，如精卵识别、受精卵着床和发育分化、组织器官形态形成、老化、癌变等。在血液与淋巴循环中，它们起着动态的更为灵敏的信号识别和调控作用，尤其是免疫系统中白细胞由血管渗出，进入受损或病原菌感染的组织部位以消灭病原菌的过程，涉及多种严重疾病，如炎症、病原菌感染、癌细胞转移、过敏和自身免疫病等。糖与人类健康关系密切，以糖生物学研究为基础的糖药物，包括糖类及可通过与糖类、糖类相关结合蛋白和酶相互作用的化合物，则具有十分广阔的应用前景。结瘤因子是由根瘤菌合成并分泌至胞外的一类脂壳寡糖，其基本骨架是由3～5个β-1，4糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖寡聚体，在非还原端酰胺基团脱乙酰基的氨基上连接一个C16～20的不饱和脂肪酸。极低浓度下，它便可引起植物根毛变形，形成侵染线，刺激根瘤的生成。NodABC主要负责结瘤因子基本骨架的合成，即不同聚合度的壳寡糖在非还原端连接一个长链不饱和脂肪酸。NodC为N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，在NodC的作用下可以合成2～5糖基组成的N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体，其催化的糖链合成方向是从糖基非还原端的4位羟基的氧原子开始，糖基供体为UDP-GlcNAc；NodB为专一性几丁寡糖脱乙酰酶，去掉几丁寡糖的末端乙酰葡萄糖胺的N-乙酰基，其作用底物为2～6个N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体。虽然，近年来糖链有机合成技术的发展日新月异，尤其是糖链固相合成技术的发展，使得许多糖链结构能够进行规模性的合成，但由于合成中仍然存在着繁琐的保护和去保护的步骤，结构较为复杂糖链还难以进行规模性的合成，而且，反应步骤的复杂性也使得寡糖的合成制备成本较高，使得对其生理功能和活性的研究难以进行。由糖基转移酶负责，将糖基供体（通常为NDP-糖）的单糖部分转移至受体而完成的糖基化过程被称为Leloir途径，用糖基转移酶对未保护的糖进行糖基化的优点在于它高度的区域和立体选择性，与化学方法相比它不需要任何保护基操作，简化了合成路线，而且合成的产物没有同分异构体，并且可以根据研究目的的需要，从头合成目的天然或非天然的寡糖产物，这一点也是利用糖苷酶进行的寡糖合成中所无法做到的。自上世纪90年代末开始至今，利用表达外源糖基转移酶的重组细菌合成目的寡糖的研究得到了迅速的发展，结合高密度发酵技术，多种具有重要生理功能的糖链结构已完成克级规模的合成制备研究。利用对表达NodC重组大肠杆菌的高密度培养，Samain等完成了对几丁五糖的合成，虽然其每升发酵液的合成得率达到克级水平以上，但由于糖基供体UDP-GlcNAc供给水平的限制，重组细菌的培养必须以较低的生长速度，才能保证合成的顺利进行，这在一定程度上影响了寡糖合成的产率。提高合成效率、降低制备成本，是目前糖合成研究需要解决的重点问题，由外源糖基转移酶在重组细菌细胞内催化进行的寡糖合成反应中，其糖基供体为糖核苷酸，重组细胞的发酵密度、重组细胞中外源蛋白的活性、糖基供体的供给浓度和目的寡糖在细胞中的积累水平等因素都对目的寡糖的合成效率有着直接的影响，本论文研究对以上因素进行系统地分析和研究，有利于提高寡糖的合成效率，为此技术的应用打下基础。论文研究结果如下：（1）nodC基因的克隆与鉴定。利用分子克隆技术，对不同根瘤菌的nodC基因进行了克隆，并通过琼脂糖电泳和核苷酸测序等技术对其进行了分子鉴定，测序结果表明：不同根瘤菌nodC基因的DNA分子大小分别为：nodCE （S．meliloti）1209 bp，nodCL （M．loti） 1275 bp，nodCA （A．cauliandans）1194 bp。（2）大肠杆菌菌株对几丁寡糖合成的影响。将重组nodCA的表达载体pC5，分别转化DH5α、DH1和BL21（DE3）等几株常用的大肠杆菌菌株，通过三角瓶振荡培养，对重组菌株的生长和几丁寡糖的合成产率进行了测定，35℃培养36h的结果表明：转化DH5α的重组细菌DC5的产糖效率最高，达到41.5 mg．L^-1培养液，寡糖含量占细胞干重的1.67％：根据测定结果，本研究筛选确定了DH5α为进一步试验的转化菌株。（3）不同表达载体对几丁寡糖合成效率的影响。利用重组nodCL基因和pET28a，pBluescript SK和pUC1g等质粒载体，分别构建了表达NodCL的重组大肠杆菌DCL1、DCL2和DCL3，三角瓶振荡培养试验结果表明：非诱导培养条件下，在删培养基中培养36h，DCL2和DCL3的寡糖合成得率可达到：13.0μg．ml^-1和35.5μg．ml^-1；但寡糖的合成对重组大肠杆菌的生长均产生一定的抑制作用，而且对DCL2的抑制作用更加明显；培养液加入0.5 mmol／L IPTG进行诱导后，重组细菌生长均受到明显抑制，而且寡糖合成无法进行。（4）不同来源的重组NodC对几丁寡糖合成的影响。利用与pC5相同的构建方式，本研究构建了表达NodCL和NodCM的重组大肠杆菌DCL3和DCM3，三角瓶振荡培养结果表明：重组细菌DCM3的细胞生长量和寡糖合成效率明显低于重组细菌DCL3和DC5。（5）培养基优化试验结果。三角瓶振荡培养的测定结果表明，在MM培养基基础上添加0.2％酵母提取物和0.2％N-乙酰氨基葡萄糖的MMYNG培养基，有利于重组细菌DCL3的生长和几丁寡糖合成，35℃培养36 h，几丁寡糖的产率达到140μg．ml^-1培养液，提高和减少N-乙酰氨基葡萄糖的添加比例，均会降低几丁寡糖的合成产率。利用不同配方的培养基，在10L全自动发酵罐内对重组细菌DCL3进行搅拌通气培养，对处于对数期大肠杆菌细胞内UDP-GlcNAc浓度的测定结果表明：相对于培养基MM和MMY，重组细菌DCL3在MMYNG培养基中发酵培养，细胞内的UDP-GlcNAc浓度、细胞生长速度和几丁寡糖的合成产率均为最高，处于对数期的DCL3细胞内UDP-GlcNAc浓度可达到76μM，培养16 h，细胞干重含量达到11.2 g．L^-1培养液，几丁寡糖产率为526 mg．L^-1培养液。以葡萄糖为唯一碳源的MYG培养基，虽然由于NodC的表达受到抑制，几丁寡糖合成产率很低，但16 h培养后，重组细菌DCL3的细胞干重含量可达到17.3g．L^-1培养液，菌体细胞的生长速度明显高于其它试验培养基的结果。（6）同步法寡糖合成的培养结果。利用甘油和N-乙酰氨基葡萄糖为碳源的培养基MMYNG作为起始培养基，对重组细菌DCL3进行补料发酵培养，培养过程中，菌体生长和细胞内几丁寡糖的合成是同步进行的，培养30 h，细胞干重含量达到16.6 g．L^-1培养液，几丁寡糖产率为775 mg．L^-1培养液，菌体生长进入对数生长期后，细胞内几丁寡糖浓度维持在46-47 mg．g^-1细胞干重。（7）二步法寡糖合成的培养结果。以葡萄糖为唯一碳源的培养基MYG作为起始培养基，对重组细菌DCL3进行补料发酵培养，培养前期，由于葡萄糖对Lac启动子的抑制作用，重组细菌只进行细胞增殖，不合成几丁寡糖，通过补料控制，在培养后期，将菌体增殖和寡糖合成调整为同步进行，二步法培养26 h，细胞干重含量达到19.8 g．L^-1培养液，几丁寡糖合成产率为929 mg．L^-1培养液，培养后期的产糖阶段，细胞内几丁寡糖浓度也达到在45-47 mg．g^-1细胞干重；培养液中菌体细胞干重的增长速度由同步培养法的0.53 g．h^-1提高至0.88 g．h^-1，几丁寡糖的合成产率为929 mg．L^-1培养液，合成效率由同步培养法的25.8 mg．L^-1．h^-1提高至35.8 mg．L^-1．h^-1，合成效率提高明显。利用活性炭的吸附洗脱和分子排阻凝胶层析等技术，对重组细菌合成的几丁寡糖产物进行了分离纯化，并通过液-质联用和核磁共振技术对产物进行了分析鉴定，鉴定结果表明，重组细菌DCL3合成的几丁寡糖产物主要为几丁四糖和几丁无糖，占总寡糖产物含量的90％以上。（8）烯丙基几丁寡糖衍生物合成结果。发酵培养结果显示，在重组细菌DCL3的补料培养液中添加化学合成的烯丙基-N-乙酰氨基葡萄糖苷，使其作为NodCL合成寡糖时的糖基受体，培养24 h，重组细菌细胞干重含量达到12.51 g．L^-1，寡糖产物合成得率为913 mg．L^-1培养液；补料前，细胞中的寡糖浓度最高达到47mg．g^-1细胞干重，补料添加烯丙基-N-乙酰氨基葡萄糖苷后，细胞中的寡糖浓度进一步提高，最高达到73.2 mg．g^-1细胞干重。几丁寡糖产物组分的分析鉴定结果：利用活性炭的吸附洗脱、分子排阻凝胶层析和制备型氨基柱的高效液相层析等技术，对重组细菌合成的几丁寡糖产物进行了分离纯化，经制备型HPLC纯化分离，共得到4种主要寡糖组分，根据ESI-MS结果分析各收集组分的分子量，分别为870（烯丙基几丁四糖），1073（烯丙基几丁五糖），830（几丁四糖）和1033（几丁五糖）；NMR对烯丙基几丁五糖的¹H谱结果也证实了对ESI-MS结果的分析；制备产物各组分的合成得率分别为：烯丙基几丁四糖154 mg．L^-1，烯丙基几丁五糖221 mg．L^-1，几丁四糖208 mg．L^-1，几丁五糖263 mg．L^-1，以上四组分占总几丁寡糖产物的88.9％。（9）几丁寡糖甲基化衍生物的合成结果。发酵培养结果：在重组细菌DCL3的补料培养液中添加化学合成的甲基-N-乙酰氨基葡萄糖苷，使其作为NodCL合成寡糖时的糖基受体，培养24 h，重组细菌细胞干重含量达到13.1 g．L^-1，寡糖产物合成得率为801 mg．L^-1培养液；补料前，细胞中的寡糖浓度最高达到46.5mg．g^-1细胞干重，补料添加甲基-N-乙酰氨基葡萄糖苷后，细胞中的寡糖浓度进一步提高，最高达到64.3 mg．g^-1细胞干重。几丁寡糖产物组分的分析鉴定结果：利用活性炭的吸附洗脱、分子排阻凝胶层析和制备型氨基柱的高效液相层析等技术，对重组细菌合成的几丁寡糖产物进行了分离纯化，通过ESI-MS对不同收集组分进行的鉴定，证明了甲基化几丁四糖（m／z，845[M+H]⁺；867[M+Na]⁺）和甲基化几丁五糖（m／z，1047[M+H]⁺；1069[M+Na]⁺）是几丁寡糖产物的主要组分。（10）重组NodB蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性鉴定。将来源于S．meliloti和M．loti的重组nodB基因以不同的酶切为点插入质粒pET28a的多克隆位点，构建得到分别表达两种根瘤菌来源重组NodB融合蛋白的表达载体pET-BMNX、pET-BMBX、pET-BLNX和pET-BLBX，SDS-PAGE的结果显示，两种来源的4个重组NodB蛋白均能在0.5 mM IPTG的诱导下，在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中表达，并主要以包涵体的形式存在。包涵体蛋白复性后，经过Ni柱的亲和层析纯化和超滤脱盐，纯化后的蛋白以10 mg．ml^-1的几丁五糖为底物进行活性鉴定，30℃，20 mM Mops（pH 7.2）酶切反应3小时后，利用TLC进行分析，结果表明，不同来源的NodB重组蛋白间，活性差异不明显，但N端融合T7-Tag的重组NodB蛋白的活性明显低于N端没有融合蛋白的重组NodB。对酶切产物进行分离纯化后，利用ESI-MS进行鉴定，结果表明，经过阳离子交换层析洗脱的寡糖产物的分子量为991，与脱去一个乙酰基的壳五糖的分子量相同。在本论文研究中，根据对表达NodC的重组细菌合成几丁寡糖试验的结果，设计并完成了二步法培养的寡糖合成工艺，提高了寡糖的合成效率，同时，该工艺也同样适用于其它寡糖产物在重组细菌细胞中的合成，是本研究的创新点之一；另外，本论文研究还首次利用对重组细菌的培养，完成了烯丙基和甲基化几丁寡糖衍生物的合成和鉴定工作，而且几丁寡糖衍生物的得率较高，烯丙基几丁无糖的产率达到221 mg．L^-1培养液，研究方法和结果都具有较强的创新性，为糖合成技术的发展提供了重要的依据。