冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是从中国哈尔滨土壤中分离得到的一种产多种化合物的吸水链霉菌,主要产物有聚醚类化合物南昌霉素(nanchangmycin)和大环内酯类化合物米尔贝霉素(milbemycin)。米尔贝霉素是一种十六元环大环内酯混合物,具有广谱、高效的抗寄生虫活性,在农业害虫防治中具有重要的经济价值。南昌霉素是一种聚醚类混合物,具有较强的杀虫活性,可被用于鸡球虫病的防治中。冰城链霉菌是米尔贝霉素的高产菌株,但由于其发酵产物多、成分复杂,这就为米尔贝霉素的纯化带来了困难,所以对其他抗生素的合成进行中断,构建米尔贝霉素单一表达的工程菌株是冰城链霉菌工业化生产的前提条件。外源遗传物质导入链霉菌的方法主要有电转化和接合转移。由于大肠杆菌-链霉菌属间结合转移操作简单,不要求宿主菌具有原生质体制备和再生技术,并且能有效的避免宿主菌的限制性系统障碍,所以目前被广泛应用。在前期对冰城链霉菌属间接和转移条件的的探索中,采用整合质粒pIJ8600作为转移质粒在孢子萌发的温度影响、接合转移培养基的选择、接合转移培养基中MgCl2浓度的选择、孢子萌发时间的选择、供体和受体比例的选择及抗生素覆盖时间的选择等方面做出了探索,最后确定冰城链霉菌接合转移效率最高时的条件为：冰城链霉菌孢子在接合转移操作前需要28℃孵育30min；接合转移选择在含有30mM MgC12的MS培养基上进行；大肠杆菌与冰城链霉菌孢子的供受比为1/10;抗生素覆盖时间为20小时。南昌霉素是一种具有杀虫活性的聚醚类化合物,其完整的PKS基因簇已于2003年从南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)扣克隆得到。本实验室于2010年完成冰城链霉菌的测序工作,得到的南昌霉素PKS基因序列与南昌链霉菌中的序列相似性极高。所以可在南昌链霉菌的南昌霉素PKS相关研究基础上,设计实验实现冰城链霉菌中南昌霉素的中断表达。通过对冰城链霉菌基因组序列的生物信息学分析,确定南昌霉素生物合成基因簇起始模块的位置。设计引物nanloading-L1和nanloading-L2,以冰城链霉菌226541的总DNA为模板,扩增出loading模块的左翼序列,与pMD19-T Vector连接构建出质粒pBC2325;然后在质粒中插入卡那霉素抗性基因(neo)构建出质粒pBC1066;再设计引物nanloading-R1和nanloading-R2,扩增出loading模块的右翼序列并与pBC1066连接,构建出质粒pBC1797;用HindⅢ和EcoRI酶切并回收连接有neo的长片段,与同样经HindⅢ和EcoRI酶切的pKC1139进行连接,构建出质粒pBC5188,最后对中断质粒进行PCR鉴定。将质粒pBC5188从大肠杆菌DH5a中提出并转入ET12567(pUZ8002),构建出用于接合转移的大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC5188)。利用接合转移方法将质粒pBC5188导入冰城链霉菌226541,筛选阳性接合子并进行鉴定。综上,本实验为冰城链霉菌工程菌株的构建及下一步遗传改造奠定了基础。