【摘 要】
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基因治疗已成为治疗恶性肿瘤、心血管疾病等遗传病的有效治疗方法之一。构建安全高效的基因传递载体是基因治疗成功实施的关键。近年来,非病毒载体(脂质体、阳离子多聚物等)由于具有比病毒载体更高的生物安全性和更低的致免疫反应性得到了广泛关注。然而,发展具有高转染效率的安全基因载体依然存在着巨大的挑战性。在众多非病毒载体中,聚酰胺胺(PAMAM)树状分子由于具有独特三维结构、正电荷和表面易于功能化等特性近年来
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基因治疗已成为治疗恶性肿瘤、心血管疾病等遗传病的有效治疗方法之一。构建安全高效的基因传递载体是基因治疗成功实施的关键。近年来,非病毒载体(脂质体、阳离子多聚物等)由于具有比病毒载体更高的生物安全性和更低的致免疫反应性得到了广泛关注。然而,发展具有高转染效率的安全基因载体依然存在着巨大的挑战性。在众多非病毒载体中,聚酰胺胺(PAMAM)树状分子由于具有独特三维结构、正电荷和表面易于功能化等特性近年来备受青睐。文献显示,可以通过表面修饰(如靶向修饰)、增加代数和调节内部结构(如包裹金纳米颗粒)等来增强PAMAM基因传递效率。PAMAM代数越高基因传递效率越好,但合成成本和材料缺陷也越大。近年来,通过超分子主客体化学合成类高代核壳结构树状大分子(CSTD)常替代高代数PAMAM用于基因传递。内部包裹金纳米颗粒增强基因传递效率的原因被认为是,其可以维持三维立体结构,从而确保足够多的基因结合位点。但分子刚性对基因传递的影响机制还有待进一步研究。另外,树状大分子另一家族新成员,含磷树状大分子因具有更优异的生物相容性、高度均匀的分子量和本身分子骨架引起的较好刚性等,逐渐应用于生物医用领域,如基因传递、肿瘤治疗等。基于此,本论文将以低代的PAMAM(3代)和含磷树状大分子(2.5代)分别为核和相同的PAMAM为壳(3代)构建两种刚性不同的CSTD,用于分子刚性对基因传递效率和在肿瘤部位富集程度影响研究。首先,我们以表面为醛基的第2.5代含磷树状大分子为核,表面为氨基的第3代聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子为壳,通过化学键合合成具有刚性内核的P-G2.5/G3 CSTD;同时通过环糊精(β-CD)和金刚烷(Ad)的主客体识别作用合成柔性结构的G3-CD/Ad-G3 CSTD。然后,通过各种表征技术对得到的两种不同刚性内核的CSTD及其与p DNA的复合物(载体/p DNA)进行评价。接着,通过体外细胞实验,对载体及载体/p DNA细胞相容性、细胞吞噬及细胞内定位进行评估以及通过绿色荧光蛋白(EGFP)和荧光素酶(Luc)表达实验评价两种载体的基因转染效率。最后,将两种CSTD螯合放射性核素99mTc,并进行多功能修饰得到99mTc-载体-DOTA-Cy5.5-PS,通过SPECT/荧光双模态成像探究材料的刚性通过高通透性和滞留效应(EPR)对其在肿瘤部位累积的影响。实验结果表明,与具有柔性结构的G3-CD/Ad-G3 CSTD相比,具有刚性内核的P-G2.5/G3 CSTD表现出更好的DNA结合能力和更强的载体/p DNA复合物的细胞摄取能力,其Luc和EGFP的表达量分别是G3-CD/Ad-G3的4.1和1.7倍,同时表现出更强的渗透肿瘤的能力。因此,本论文的实验结果进一步证实载体分子刚性的改善有利于提高基因传递效率以及渗透肿瘤的能力。该成果为未来增强非病毒基因传递载体的设计提供了新的思路。
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