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第一部分:骨化三醇对AngⅡ诱导的CKD小鼠肾小管间质炎症的影响目的:探讨骨化三醇对血管紧张素Ⅱ致慢性肾损伤小鼠肾小管间质炎症影响及途径。方法:1.将7-8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为control组(5只)、AngⅡ组(5只)、AngⅡ+骨化三醇灌胃组(5只)。以上各组均行左肾切除一周后,皮下植入渗透压微泵,control组皮下泵入生理盐水,AngⅡ组皮下泵入AngⅡ,AngⅡ+骨化三醇灌胃组泵入AngⅡ并予骨化三醇灌胃,给予处理14天。2.评估各组小鼠尿白蛋白/肌酐比值、血清尿素氮、肌酐、血清钙及肾小管间质病理改变,应用免疫组织化学评估肾间质CD3(+)淋巴细胞及F4/80(+)巨噬细胞浸润情况。3.应用q PCR、ELISA检测各组小鼠右肾组织的TNF-α和IL-6m RNA和蛋白表达情况。4.应用Western Blot及免疫组化检测IKKβ、IκBα、p65表达情况。结果:1.切除左侧肾脏皮下泵入AngⅡ14天后,小鼠出现了慢性肾脏病损伤表现,应用骨化三醇干预的小鼠肾组织中小管间质损伤减轻、炎症细胞浸润减少,尿白蛋白及肾功能生化指标较AngⅡ+vehicle组改善,血清钙有所恢复。2.q PCR结果显示AngⅡ组中TNF-α、IL-6 m RNA表达较control组明显升高,应用骨化三醇干预后,TNF-α、IL-6 m RNA表达较AngⅡ组下降。ELISA结果显示AngⅡ组右肾TNF-α、IL-6蛋白较control组明显升高,应用骨化三醇干预后,TNF-α、IL-6较AngⅡ组显著下降。3.Western Blot显示AngⅡ组相比control组磷酸化IKKβ和磷酸化IκBα明显增高,核内p65/胞浆p65比值升高,而AngⅡ+骨化三醇组比AngⅡ磷酸化IKKβ和磷酸化IκBα减少,核内p65/胞浆p65比值降低,提示转入细胞核内的p65减少。4.免疫组织化学结果观察到control组中肾小管内p65蛋白基本全部表达于肾小管上皮细胞胞浆,AngⅡ组中肾小管内p65蛋白集中表达在小管上皮细胞核中,AngⅡ+骨化三醇灌胃组中有部分肾小管细胞p65被滞留在细胞浆中。结论:1.骨化三醇能够减轻由血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管间质炎症。2.骨化三醇可通过抑制肾脏NF-κB通路激活减少炎症介质产生,从而减轻AngⅡ诱导的肾小管间质炎症反应。第二部分:骨化三醇对AngⅡ致CKD小鼠肾脏中A20表达的影响目的:锌指蛋白A20是一种强效抗炎症调节蛋白,能够通过对NF-κB负性调控发挥抗炎的作用,在炎症相关性疾病、自身免疫性等疾病中起到抑制过度炎症的保护作用。A20在急性损伤如急性肾缺血再灌注肾损伤中的作用研究比较多,然而在慢性肾脏病中的作用报道较少。在本研究中,我们运用第一部分实验中构建的小鼠慢性肾脏病模型,检测骨化三醇对于肾脏A20表达水平的影响。方法:1.使用前述CKD小鼠,即健康雄性的C57BL/6小鼠随机分为control组(5只)、AngⅡ组(5只)、AngⅡ+骨化三醇灌胃组(5只)。以上各组均行左肾切除后皮下植入渗透压微泵,control组皮下泵入生理盐水,AngⅡ组皮下泵入AngⅡ,AngⅡ+骨化三醇灌胃组皮下泵入AngⅡ并予以骨化三醇灌胃。以上各组给予处理14天。2.应用q PCR、Western Blot及免疫组化法检测各组右肾中A20的表达情况。结果:1.A20主要在肾小管上皮细胞表达,control组及AngⅡ组中表达较低。2.AngⅡ+骨化三醇组中A20在肾小管上皮细胞中表达明显升高。结论:1.A20在control组中表达比较低,血管紧张素Ⅱ泵入14天对肾小管上皮细胞A20蛋白的表达无显著影响。2.在血管紧张素Ⅱ诱导的慢性肾损害过程中,骨化三醇干预可以上调肾小管上皮细胞A20蛋白的表达。第三部分:A20蛋白在骨化三醇抑制AngⅡ诱导的大鼠肾小管上皮细胞炎症反应中的作用目的:骨化三醇对于NF-κB途径具有抑制作用,同时骨化三醇能够上调肾小管上皮细胞A20蛋白的表达,鉴于A20蛋白是NF-κB通路重要的负性调节蛋白,因此本部分实验探讨A20是否在骨化三醇抑制AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞炎症反应中起到作用。方法:1.用不同浓度的骨化三醇刺激野生大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞,通过Western Blot检测不同浓度和时间作用下骨化三醇对A20蛋白表达的影响。应用q PCR检测AngⅡ(10-6M)刺激NRK-52E后TNF-α、IL-6 m RNA在不同时间点的表达情况。通过以上实验为下一步实验选择最佳骨化三醇作用浓度和时间。2.以购自上海吉凯生物技术公司的慢病毒为载体,转染sh RNA到野生NRK-52E抑制A20蛋白表达,并用q PCR验证A20敲低效率。3.转染空载病毒NRK-52E细胞为sh CTRL,转染了抑制A20表达sh RNA的NRK-52E细胞为sh A20。以sh CTRL、sh A20细胞为实验对象,分为control组、sh CTRL+AngⅡ组、sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组、sh A20+AngⅡ+骨化三醇组,以AngⅡ或AngⅡ骨化三醇处理相应组细胞24h,运用q PCR、Western Blot检测A20表达情况。4.以sh CTRL及sh A20细胞为实验对象,分为control组、sh CTRL+AngⅡ组、sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组、sh A20+AngⅡ+骨化三醇组,以AngⅡ或AngⅡ骨化三醇处理相应组细胞24h。应用q PCR、ELISA检测TNF-α及IL-6在各组表达情况。5.在control组、sh CTRL+AngⅡ组、sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组、sh A20+AngⅡ+骨化三醇组中,应用Western Blot检测IKKβ、IκBα、p65在各组的表达;在各组中运用免疫荧光激光共聚焦检测A20与p65表达情况。结果:1.不同浓度骨化三醇处理野生大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E后,A20蛋白表达在10-7M达到高峰,继续增加骨化三醇浓度未见A20蛋白进一步增高。骨化三醇处理野生NRK-52E细胞后在24h内A20表达随时间延长逐渐升高。血管紧张素Ⅱ刺激NRK-52E 24h后,TNF-α及IL-6仍保持在较高表达水平。综上我们选择骨化三醇干预浓度为10-7M,干预时间为24h。2.以慢病毒为载体转染抑制A20表达的sh RNA进入野生NRK-52细胞成功制备了A20敲低效率在70%以上的细胞。3.q PCR及ELISA结果显示AngⅡ刺激24h后,TNF-α及IL-6m RNA及蛋白明显上升,而sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组、sh A20+AngⅡ+骨化三醇两组中TNF-α及IL-6明显下降,但sh A20+AngⅡ+骨化三醇组中TNF-α及IL-6表达明显高于sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组。4.Western Blot检测示AngⅡ刺激后,磷酸化IKKβ及磷酸化IκBα明显增加,细胞核内p65明显增加,骨化三醇干预后磷酸化IKKβ及磷酸化IκBα减少,p65转核减少,提示更多p65滞留在胞浆。但在sh A20+AngⅡ+骨化三醇组中磷酸化IKKβ、磷酸化IκBα及进入核内p65明显高于sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组。5.免疫荧光激光共聚焦示在control组中p65均在胞浆表达,胞浆A20表达较低,AngⅡ刺激24h后,p65绝大部分转入细胞核内,A20在AngⅡ处理24h后仍为较低水平,sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组中A20表达明显增多,p65入核减少。然而在sh A20+AngⅡ+骨化三醇组细胞中,虽然经过骨化三醇干预,但细胞核内p65比sh CTRL+AngⅡ+骨化三醇组多。结论:1.骨化三醇持续诱导大鼠肾小管上皮细胞A20表达。2.骨化三醇可以通过上调A20蛋白抑制AngⅡ诱导的大鼠肾小管上皮细胞NF-κB激活,从而降低下游TNF-α和IL-6的表达。3.锌指蛋白A20参与了骨化三醇对IKKβ及IκBα磷酸化的抑制从而抑制NF-κB通路,但A20可能只是骨化三醇抑制NF-κB途径之一。第四部分:骨化三醇对AngⅡ诱导的NRK-52E细胞上皮间充质转分化的影响及机制目的:AngⅡ除了可以通过诱导小管细胞炎症反应,还可诱导小管上皮细胞的上皮间充质转化(EMT)损伤细胞。有研究表明Wnt/β-catenin通路参与了AngⅡ诱导的EMT。在本部分实验中我们探讨骨化三醇是否通过干扰Wnt/β-catenin通路抑制AngⅡ诱导EMT对小管细胞起到保护作用。方法:1.以大鼠小管上皮细胞为研究对象,用不同浓度AngⅡ(0M、10-8M、10-7M、10-6M)刺激,再以10-6M AngⅡ刺激小管细胞不同时间(0h、24h、48h、72h),通过q PCR、Western Blot检测上皮细胞标记物E-cadherin和间充质标记物vimentin m RNA及蛋白表达情况。2.以大鼠小管上皮细胞为研究对象,分为control组、Ang组、Ang组+吡维氯胺组(pyrvinium pamoate,Pyr),用Pyr干预AngⅡ刺激的小管细胞,q PCR和Western Blot检测c-myc、cyclin D1、vimentin、E-cadherin m RNA及蛋白表达情况,Western Blot测定p-serine9-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin蛋白表达。3.以大鼠小管上皮细胞为研究对象,分为control组、Ang组、Ang+氯沙坦组、Ang+PD123319组,用氯沙坦、PD123319分别阻断AngⅡ与AT1R、AT2R受体结合,Western Blot测定p-serine9-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin蛋白表达,用q PCR和Western Blot检测vimentin、E-cadherin m RNA及蛋白表达情况。4.以大鼠小管上皮细胞为研究对象,分为control组、Ang组、Ang组+骨化三醇组,用骨化三醇干预AngⅡ刺激的细胞,Western Blot测定p-serine9-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin蛋白表达情况,用q PCR、Western Blot及免疫荧光法检测vimentin、E-cadherin m RNA及蛋白表达情况。结果:1.q PCR和Western Blot结果显示随着AngⅡ浓度上升,vimentin m RNA及蛋白表达逐渐上升、E-cadherin m RNA及蛋白表达逐渐减少,随着AngⅡ刺激时间延长,Vimentin m RNA及蛋白表达逐渐上升、E-cadherin m RNA及蛋白表达逐渐减少。2.AngⅡ促进GSK3β在9位丝氨酸磷酸化,吡维氯胺可以阻断AngⅡ诱导的GSK3β磷酸化。同时AngⅡ减少磷酸化β-catenin导致非磷酸化β-catenin增加,吡维氯胺可以阻断AngⅡ所致磷酸化β-catenin的降低。q PCR和Western Blot显示AngⅡ刺激后Wnt/β-catenin靶产物cyclin D1、c-myc明显增加,用吡维氯胺(Pyr)阻断该通路后,Wnt/β-catenin通路靶产物c-myc、cyclin D1与control组表达无显著性差异。q PCR和Western Blot显示Pyr干预能够减少AngⅡ诱导的vimentin表达升高,同时能够部分恢复E-cadherin的表达。3.用AngⅡ受体阻断剂氯沙坦、PD123319分别阻断AngⅡ与AT1R、AT2R受体结合。q PCR和Western Blot显示AngⅡ+氯沙坦组vimentin、E-cadherin与control组无明显差异,AngⅡ+PD123319组vimentin、E-cadherin与AngⅡ组无明显差异。Western Blot显示AngⅡ+氯沙坦组p-serine9-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin与control组表达无显著性差异,AngⅡ+PD123319组p-serine9-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin与AngⅡ组表达无显著性差异。4.用骨化三醇干预后,q PCR和Western Blot显示AngⅡ+骨化三醇组中vimentin比AngⅡ组显著下降、E-cadherin比AngⅡ组显著上升。Western Blot显示p-serine9-GSK3β比AngⅡ组显著下降、β-catenin比AngⅡ组显著下降,而p-β-catenin比AngⅡ组显著上升。免疫荧光显示骨化三醇可以降低AngⅡ诱导的Vimentin的增加,使E-cadherin表达部分恢复。结论:1.AngⅡ以浓度依赖和时间依赖的方式促进大鼠肾小管上皮细胞发生EMT。2.Wnt/β-catenin通路参与了AngⅡ诱导的EMT。3.AngⅡ通过AT1R受体促进EMT,AT2R受体对EMT无明显影响。4.骨化三醇通过干扰Wnt/β-catenin通路的激活抑制AngⅡ诱导的EMT。