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研究背景与目的:临床研究发现,大脑皮质发育障碍（malformations of cortical development,MCDs）是儿童和青少年药物难治性癫痫的主要病因[1]。有资料显示,约40%的药物难治性癫痫患者手术切除标本的病理结果提示MCDs[2]。MCDs是由一个或多个大脑发育步骤改变导致的大脑皮质发育异常类疾病,其步骤改变包括神经元前体细胞的异常增殖和迁移等[3]。根据临床病理分型,MCDs包括较常见的局灶性皮质发育不良（Focal cortical dysplasia,FCD）和结节性硬化（Tuberous sclerosis complexes,TSCs）,以及相对少见的无脑回畸形,多小脑回和灰质异位等[4]。其中,FCD是药物难治性癫痫常见的病理类型,于1971年由Taylor首次报道发现[5]。在临床研究中,FCD存在与癫痫发作程度密切相关的“异构神经元”,如气球样细胞（balloon cells,BCs）;另有研究提示,BCs可能来源于室管膜下区（Subventricular zone,SVZ）的神经前体细胞（Neural precursor cells,NPCs）[2]。Alfonso等研究发现,与大脑皮质发育相关的神经元异常增殖和胶质增生是FCD的主要原因之一[6]。在大脑皮层局部冰冻损伤-皮质发育不良模型（FL-CD）中证实,位于SVZ区的神经前体细胞（NPCs）可以通过长距离迁移至冰冻损伤皮层,造成皮层结构紊乱形成异构皮层[7,8]。Nulty等研究发现,来自SVZ区的神经前体细胞（NPCs）之一——放射状胶质细胞（Radial glial cells,RGCs）,在大脑皮层发育过程中表现出了不同的表达模式,对新生神经元的增殖迁移发挥着重要的调节作用[9]。RGCs在大脑发育早期可作为神经干细胞产生神经元或胶质细胞（少突胶质细胞或星形胶质细胞）;发育中晚期则可以为新生神经元提供放射状纤维“支架”,引导其向浅表皮层进行放射状迁移,承担“迁移脚手架”的作用[10]。肝X受体β（Liver X Receptorβ,LXRβ）作为RGCs的关键调控因子,参与了其正常转化和迁移的过程[11]。LXRβ作为参与脂质代谢的重要核受体,在机体组织中广泛表达,并且在中枢神经系统中参与了不同退行性疾病的发生发展,被认为是该类疾病潜在的治疗靶点备受关注[12]。值得注意的是,LXRβ的表达在FCD患者手术切除标本中显著下调,并且与RGCs特异性标记物脑脂结合蛋白（Brain lipid binding protein,BLBP）共同表达于异构神经元[13]。而在LXRβ敲除小鼠中发现,LXRβ缺失可以通过激活TGF-β1/Smad4信号通路促进RGCs细胞向星形胶质细胞转化,从而影响早期的大脑皮质发育[11]。综上所述,LXRβ下调是否通过调控RGCs细胞的迁移和转化参与了FCD异构皮层的发生发展值得我们关注。本次研究中,我们通过建立小鼠大脑皮层局部冰冻损伤-皮质发育不良（Freezing lesion-cortical dysplasia,FL-CD）模型,观察LXRβ和BLBP蛋白在冰冻损伤侧皮层中的表达情况,并通过腹腔注射LXRs激动剂（TO901317）和LXRs阻断剂（GSK2033）探寻LXRβ对FL-CD模型小鼠皮层结构及功能的影响。材料与方法:1、利用新生C57BL/6野生型（WT）小鼠构建局部皮层冰冻损伤-皮质发育不良模型（FL-CD）,模拟大脑皮质发育不良,并设立假手术组（sham）作为对照。分别于造模后2天、7天、10天、14天获取大脑损伤侧皮层,采用苏木精-伊红染色（HE）评估该模型损伤侧皮层发育情况,并进一步采用蛋白印迹实验（Western blot）和免疫组化实验（IHC）,了解LXRβ和BLBP在FL-CD组和sham组小鼠大脑皮层的表达和分布情况。2、建立FL-CD小鼠模型后,通过连续2天（P0/P1）腹腔注射LXRs激动剂TO901317、阻断剂GSK2033及同等剂量1%DMSO生理盐水稀释液分别建立激动剂组（以下简称FL-CD+TO组）、阻断剂组（FL-CD+GSK组）及DMSO对照组（FL-CD+DMSO）,三组小鼠于造模后2天、7天、10天、14天经心灌流获取损伤侧皮层,通过免疫荧光染色实验,评估LXRβ和BLBP在冰冻损伤后异构皮层中的细胞学分布。3、在建模后8周,分别对FL-CD+DMSO组、FL-CD+TO组以及FL-CD+GSK组安装皮层监测电极以实施在体皮层脑电监测,评估该模型小鼠皮层放电的变化情况。结果:1、成功构建FL-CD模型,该模型小鼠大脑皮层微脑回畸形和异构皮层形成。2、蛋白印迹实验结果显示,与sham组相比,LXRβ和BLBP在FL-CD组损伤侧异构皮层中表达明显下调（P2/P7/P10）,差异具有统计学意义;免疫组化染色实验平均光密度统计获得了类似的结果。3、FL-CD建模早期,皮层损伤严重,P2时损伤侧皮层主要表现为出血、水肿。而在后续观察时间点的FL-CD+DMSO组、FL-CD+GSK组和FL-CD+TO组模型小鼠中（P7）,我们均观察到有大量GFAP标记的星形胶质细胞在损伤侧皮层聚集形成“胶质迁移流”,并在迁移流中发现大量LXRβ/GFAP共标阳性的细胞。4、免疫荧光染色双标实验结果显示,与FL-CD+DMSO组相比,FL-CD+TO组异构皮层胶质增生减轻,并有大量的LXRβ/GFAP共标阳性的细胞在异构皮层“胶质迁移流”中聚集,差异具有统计学意义（P7/P10/P14）;而FL-CD+GSK组异构皮层胶质增生加重,异构皮层“胶质迁移流”中LXRβ/GFAP共标阳性的细胞减少,差异具有统计学意义（P7/P10/P14）。而BLBP/GFAP的免疫荧光染色双标实验结果显示,与FL-CD+DMSO组相比,FL-CD+TO组异构皮层内BLBP/GFAP共标阳性的细胞占总体BLBP阳性细胞的比例明显减少,而FL-CD+GSK组中共标细胞占比增加,证实冰冻损伤侧异构皮层LXRβ表达下调促进了RGCs向星形胶质细胞转化参与了皮层胶质增生的过程。5、LXRβ表达下调导致冰冻损伤侧异构皮层脑电能量释放增加,脑电时频分析结果显示,与FL-CD+DMSO组和FL-CD+GSK2033组相比,FL-CD+TO901317组小鼠的皮层脑电的基线能量较低,提示LXRβ上调有可能降低小鼠痫样放电的几率。结论:1、FL-CD模型小鼠冰冻损伤侧异构皮层LXRβ表达下调,并且与BLBP表达呈正相关性。2、激动剂TO901317可以通过上调LXRβ表达调控放射状胶质细胞（RGCs）减少其向星形胶质细胞转化,从而减轻异构皮层内胶质增生,而阻断剂GSK2033则可能产生了相反的作用。3、LXRβ表达下调可能使FL-CD模型小鼠的痫样放电几率增加。综上所述,在FL-CD模型中我们观察到异构皮层LXRβ与BLBP表达下调,并发现LXRβ下调可能通过调控RGCs参与了异构皮层的胶质增生,进而参与FL-CD模型小鼠异构皮层的病理发生,并且可能影响皮层神经兴奋性。上调LXRβ内源性表达或许是预防FCD难治性癫痫发生的策略之一。