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目的:观察皮瓣组织发生缺血再灌注后形态学的变化;对比研究皮瓣组织缺血再灌注组与非缺血再灌注组细胞凋亡的变化规律;对比研究缺血再灌注组与非缺血再灌注组的皮瓣组织不同时间点Fas蛋白的表达情况;对比研究缺血再灌注组与非缺血再灌注组的皮瓣组织在不同时间点相关凋亡基因Fas的表达情况。以阐明Fas基因在皮瓣缺血再灌注中的作用,探讨缺血再灌注损伤时细胞凋亡与Fas基因的关系,为从基因水平,防治皮瓣缺血再灌注损伤,提高皮瓣成活率,提供新思路和理论依据。方法:1实验动物:雄性健康清洁级WISTAR大鼠50只,称重、编号。2动物模型建立:于皮瓣制作前三天,各组大鼠用8%的硫化钠腹部脱毛备皮(面积为4×10cm~2),温水冲洗后自然晾干。以3%戊巴比妥钠(40mg/Kg体重)腹腔注射麻醉,每3小时追加麻醉一次(20mg/Kg体重)以维持麻醉。麻醉成功后大鼠仰卧位,四肢固定,75%酒精消毒,于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣,大小约3㎝×6㎝。3实验动物分组:将大鼠分为两组,(1)非-IR组25只:皮瓣形成后原位缝合,不做任何处理。时间点的选取以形成皮瓣后8h、9h、14h、20h、32h分为五组与实验组形成对照,每组五只大鼠。IR组25只:皮瓣形成后,微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉,手术显微镜下观察,确认血流阻断后,3-0丝线原位缝合皮瓣,切口再次消毒。8h后再次手术去除血管夹,并经手术显微镜下观察,确认恢复血流,再灌注成功。按去除动脉夹血管再灌注后0h、1h、6h、12h、24h分为五组,每组五只大鼠。4取材:非-IR组和IR组按照各组时间点的要求,分别于皮瓣中间边缘处取皮瓣组织1.0cm×0.5cm,所取标本中一部分用多聚甲醛迅速固定待做石蜡切片及免疫组化染色,准备做细胞凋亡和Fas的检测。部分液氮冰冻后,置冰箱中保存,以备RT-PCR检测。5检测方法及观测指标5.1组织学检查:将石蜡切片进行HE染色,观察组织结构改变。5.2凋亡细胞原位末端标记(TUNEL法)检测:应用TUNEL法原位标记DNA片段检测皮瓣组织不同时间点凋亡细胞,凋亡细胞阳性指数用平均阳性细胞数与总细胞数的比值表示(AI,AI =凋亡细胞数目/总细胞数目×100%)。5.3 Fas基因蛋白表达检测:应用免疫组化(SP)法检测皮瓣组织中凋亡细胞在术后不同时间点Fas蛋白表达。用计算机图象分析系统分析单位面积下阳性细胞的平均灰度值,分别取其平均值表示该切片Fas蛋白表达的情况。5.4 Fas mRNA表达检测:应用RT-PCR检测皮瓣组织中Fas基因表达在术后不同时间点的表达变化规律。用凝胶图象分析系统(武汉同济医科大学HMIAS-2000型)对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。6统计学处理:所有的试验数据以均数±标准差( X±S)表示,采用SPSS16软件进行检验,显著性分析以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1 HE染色观测结果:IR组较非-IR组比较,皮下水肿较明显,皮肤各层结构紊乱、疏松、有大量的炎性细胞聚集、粘附于微血管内皮细胞,微血管管壁损伤,完整性破坏,有大量炎性细胞渗出到组织间隙,部分红细胞堆积在毛细血管和微静脉周围。2 TUNEL法观察细胞凋亡:应用TUNEL法对皮瓣组织的凋亡细胞检测,发现IR组及非-IR组均发生细胞凋亡,阳性细胞主要位于表皮层,皮下组织偶可见散在阳性细胞。IR组明显高于非-IR组(P<0.05)。3 Fas蛋白的表达:本实验观测到,在非-IR组中皮瓣组织Fas蛋白表达为弱阳性平均灰度值在每个时间点间差别无统计学意义。IR随着缺血和再灌注时间的增加,Fas蛋白表达急速上升,到再灌注后12h达到了高峰,阳性细胞可连成线片状,染色最深,24h表达减弱。非-IR组与IR组通过SPSS分析有显著性差异(P<0.05)。4 Fas mRNA的表达:应用RT-PCR法发现在非-IR组中皮瓣组织Fas基因表达弱阳性,各个时间点的变化无统计学意义(P>0.05)。IR组随着缺血再灌注时间延长,Fas基因表达水平程增高趋势,到再灌注后12h达到高峰, IR24h组较IR12h组表达减弱。非-IR组与IR组通过SPSS分析有显著性差异(P<0.05)。结论:1皮瓣缺血再灌注损伤后可加速细胞凋亡。2皮瓣组织缺血再灌注损伤时,Fas蛋白表达显著增多,与皮瓣Fas基因转录表达mRNA一致。3皮瓣组织缺血再灌损伤过程中细胞凋亡起到相关调控的作用,相关凋亡基因Fas参与诱导了细胞凋亡的过程。