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稻瘟病是由稻瘟病菌引起的严重危害水稻生产和粮食安全的重要病害。稻瘟病菌与水稻的互作系统已成为研究病原菌与寄主植物互作的模式系统。分析稻瘟病菌致病相关基因的功能,阐明稻瘟病菌致病机理,可为研发新的环境友好型杀菌剂提供更多的研究背景,有效控制该病害。泛素化作为真核细胞中重要的蛋白翻译后修饰,参与蛋白活性、寿命以及定位的调节。其中,泛素连接酶E3在泛素系统中种类数目最多,决定底物蛋白的特异性。研究泛素连接酶在稻瘟病菌致病过程中的作用,对于认识泛素系统的调节功能具有重要意义,同时为稻瘟病的防治提供新思路。本研究以泛素连接酶为主要研究对象,系统分析了稻瘟病菌泛素连接酶E3在生长发育和致病性方面的功能。 首先,分析了泛素结合酶MoRAD6介导的泛素化在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的作用。敲除MoRAD6导致稻瘟病菌在生长、产孢、孢子萌发、附着胞形成和侵染能力方面产生严重缺陷。泛素结合酶功能的实现依赖于下游的泛素连接酶,为了阐明MoRAD6如何参与生理功能调控,我们通过基因敲除获得了三个与其互作的泛素连接酶MoBRE1、MoUBR1和MoRAD18的突变体并进行了功能分析。MoRAD18的缺失突变体没有明显的表型变化。对MoBRE1基因缺失突变体的分析表明其参与稻瘟病菌的生长,产孢和致病过程,定位于细胞核,调控组蛋白H3第四位赖氨酸上二甲基化和三甲基化水平。MoUBR1对孢子粘附和萌发至关重要,ΔMoubr1孢子粘附能力下降,孢子萌发显著延迟。荧光报告蛋白降解试验表明MoUBR1参与N端准则调控的蛋白降解。外源添加cAMP部分恢复突变体ΔMoubr1的孢子萌发,突变体ΔMoubr1孢子中cAMP含量也较野生型Guy11孢子中降低。MoIRA1是酵母GTPase激活酶IRA12的同源蛋白,ΔMoira1突变体孢子萌发提前,同时体内Pmk1磷酸化水平升高,表明MoIRA1负调控孢子萌发和Pmk1磷酸化。在突变体ΔMoubr1中敲除MoIRA1可以恢复孢子萌发缺陷,表明MoIra1可能受MoUbr1介导的N端准则调控孢子的萌发。以上结果表明cAMP/PKA信号途径和Pmk1信号途径在稻瘟病菌孢子萌发过程中具有重要作用,MoRAD6介导的泛素化主要通过MoBRE1I和MoUBR1参与稻瘟病菌侵染相关的发育和致病过程。 其次,我们对稻瘟病菌中91个泛素连接酶相关基因进行敲除,最终得到73个基因的敲除突变体,并且分析了这73个泛素连接酶敲除突变体在稻瘟病菌生长、产孢、孢子萌发、附着胞形成、致病性以及10种逆境胁迫下的表型变化。其中,20个突变体在产孢方面有显著性差异,6个突变体ΔMotom1、ΔMopex10、ΔMopex2、ΔMovps41、ΔMocdc4和ΔMomet30产孢显著减少,ΔMovps41突变体不产孢。突变体ΔMotom1、ΔMope10、ΔMopex2、ΔMocdc4和ΔMomet30分别在生长、孢子萌发、附着胞形成和致病性方面存在不同程度的缺陷。MoPEX10、MoPEX2和MoVPS41参与有性生殖,缺失后影响子囊壳形成。Mo VP S41在孢子中的表达量较菌丝阶段和附着胞侵染阶段少,荧光定位表明该基因定位于液泡膜,在液泡间交界面荧光较强。Mo VPS41参与膜融合,缺失后菌丝内液泡为零散的小液泡,同时自噬过程受损。Mo VPS41还参与细胞内金属离子平衡调控,缺失突变体ΔMovps41对金属离子敏感性增强。SMART软件预测MoVPS41包含三个功能域,分别为WD40domain、Clathrin domain和RING domain,三个功能域对Mo VP S41功能都是必需的,缺失任何一个功能域都不能回补突变体的生长产孢和致病性。 综上所述,本研究系统分析了泛素连接酶E3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能,分析了泛素结合酶MoRAD6与三个相关的泛素连接酶MoBRE1、MoUBR1和MoRAD18在稻瘟病菌侵染相关生物学过程中作用,揭示了MoUBR1和MoIRA1在孢子萌发过程中的正向和反向调控。发现了与致病性相关的6个基因MoTOM1、MoPEX10、MoPEX2、MoVPS41、MoCDC4和MoMET30,并着重分析了MoVPS41在稻瘟病菌生长发育和致病性中的功能。