研究背景和目的许多的研究表明IL-21在肿瘤动物模型中具有抗肿瘤作用,例如黑色素瘤、胰腺肿瘤、乳腺腺瘤和膀胱癌动物模型。相反地,其他研究表明IL-21具有促进炎症环境形成而诱导肠炎相关的结肠癌发生。但是目前IL-21R信号通路在肝癌发展中的作用并不是很明确。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种炎症相关的肿瘤。HCC的免疫抗原特性、肿瘤免疫微环境和肿瘤免疫抑制微环境之间的相互作用共同驱动HCC的发生和发展。因此,HCC中参与免疫应答的因素和免疫抑制应答的因素之间的平衡对控制肝癌的生长、浸润和转移起着关键性作用。然而,在HCC生长中调控免疫应答反应和免疫抑制应答反应的平衡机制目前了解的很少。在本研究中,我们通过利用IL-21R敲除小鼠(IL-21RKO)和建立两种HCC小鼠模型,探讨IL-21R信号通路在HCC生长中的作用及其机制和其在维持机体免疫系统平衡和肿瘤细胞的记忆性免疫应答中的作用。研究方法首先,我们建立两种小鼠肝癌模型:皮下肝癌模型和原位种植性肝癌模型。利用这两种肝癌模型,通过对比分析IL-21R KO小鼠和正常小鼠生存情况、肝肿瘤形态学和组织病理学改变,分析IL-21R信号通路在肝癌生长中的作用。为了进一步研究IL-21R信号通路影响肝癌生长的机制,首先,利用MTT实验体外检测IL-21对小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞增殖是否有直接的作用;接着,利用免疫组化技术、流式细胞分析技术分析IL-21R KO和WT荷瘤小鼠肝肿瘤内免疫细胞浸润及其功能情况;最后,分析IL-21RKO和WT种植性肝癌小鼠脾内和肠系膜淋巴结内免疫细胞变化情况,整体观察IL-21R KO小鼠免疫系统状态。其次,为了研究IL-21R信号通路在再次肿瘤免疫应答中的作用,我们通过对IL-21R KO和WT小鼠两次接种皮下肿瘤细胞(第二次在第25天接种),观察两次皮下肿瘤生长情况;利用流式细胞技术分析小鼠外周血免疫细胞的动态变化情况;分析了再次接种肿瘤细胞后小鼠脾内和骨髓内免疫细胞的改变情况。最后,我们在PubMed网站的GEO数据库中下载肝癌患者基因表达芯片GSE14250数据,分析肝癌内和肝癌旁IL-21和IL-21R表达水平;利用Kaplan-Meier生存分析法及log-rank检验分析肝癌内和肝癌旁IL-21和IL-21R表达水平与患者总生存时间和复发时间的关系。研究结果本研究成功建立了皮下种植性肝癌小鼠模型和原位种植性肝癌小鼠模型。在这两种肝癌模型中,通过分析小鼠生存时间、体重、肝肿瘤形态学和病理学指标的改变,证实IL-21R信号通路缺失具有快速促进肝癌细胞生长的作用。对其机制的进一步研究,结果显示IL-21R信号通路缺陷导致肝肿瘤内、脾内和淋巴结内抗肿瘤免疫细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞)浸润减少,而促肿瘤免疫抑制性细胞(MDSCs、TAMs和Treg细胞)聚集增加;IL-21R KO小鼠肝肿瘤内CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞产生IFN-γ能力降低;我们发现IL-21RKO小鼠脾内抗原提呈细胞(B细胞、CDllc+DC细胞、pDC和cDC)频数明显减少和抗原提呈能力减低。这些数据表明IL-21R信号通路缺陷损伤肝肿瘤内抗肿瘤免疫细胞的功能,同时导致荷瘤小鼠全身免疫系统失衡。其次,在两次接种肿瘤细胞后,在WT小鼠中,与第一次皮下肿瘤对比,第二次皮下肿瘤生长速度变慢,肿瘤体积明显变小,最后肿瘤基本消失;然而,在IL-21R KO小鼠中,第一次皮下肿瘤和第二次皮下肿瘤的生长速度和体积大小相一致,表现为快速生长,这表明IL-21RKO小鼠对再次接种肿瘤细胞未产生记忆免疫应答反应;小鼠外周血、脾内和骨髓内免疫细胞变化结果显示,在第二次接种肝癌细胞后(day 25-43),IL-21RKO抗肿瘤免疫细胞频数或活性明显低于WT小鼠;而促肿瘤免疫抑制细胞频数明显升高。因此,这些结果表明IL-21R信号通路在形成肿瘤特异记忆性免疫应答中发挥重要作用。最后,利用GEO中人HCC基因芯片数据库(GSE14520)分析,发现肝癌旁组织中IL-21和IL-21R表达水平明显高于肝癌组织;并且肝癌旁组织中IL-21表达水平和肝癌内IL-21R表达水平与HCC患者总生存时间和复发时间成正相关。这些结果证明人HCC患者中IL-21/IL-21R信号通路是控制HCC进展的保护因素。研究结论本研究通过建立两种肝癌小鼠模型,证明IL-21R信号通路通过增加肿瘤中T细胞、NK细胞和NKT细胞的活性及功能,减低肿瘤内免疫抑制性细胞(MDSCs和调节性T细胞)的聚集,从而抑制肝癌生长;而且证明IL-21R信号通路在对肿瘤产生记忆性免疫应答和维持全身免疫系统平衡中发挥关键作用。