论文部分内容阅读
背景:宫颈癌是世界范围内威胁女性生命的第二大恶性肿瘤。近年来,我国宫颈癌发病率呈上升趋势,发病年龄趋于年轻化。宫颈癌的发生是多基因参与的多步骤的病理过程,其前驱病变称为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN),包含CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ(含原位癌)。CIN的发生与进展存在着很多不确定因素,且临床表现多样性:(1)CINⅠ(低级别)中有20%病例可进展为CINⅡ/Ⅲ(高级别),50%-60%的可自发性消退;而40%-50%的CINⅡ/Ⅲ可进展为浸润癌。但细胞学和组织学难以鉴别自发性消退或发展为浸润癌的病变。(2)宫颈癌的发生与高危HPV感染有关。尽管大多数CIN患者有HPV感染,但仅有少数病例可发展为浸润癌。因此,紧密结合CIN病理诊断和临床治疗需要,评价促进CIN发生与进展的风险因子,使CIN分级更符合其生物学行为,以提高对CIN患者治疗的合理性、治愈率和生活质量,防止对CIN过度治疗或治疗不足,对实现宫颈癌的早期防治具有重要意义。目的:研究CIN的克隆性特征及人乳头瘤病毒HPV16(human papillomaviroustype16,HPV16)E6基因整合状态和P16蛋白表达情况,探讨这些分子变化与CIN病理分级的相关性及其意义。方法:从同济大学附属东方医院病理科存档的2000—2005年活检或手术切除的宫颈标本中,随机选取150例,其中CINⅠ33例,CINⅡ38例,CINⅢ34例,宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)45例。另选取非宫颈病变切除的宫颈组织20例为对照组。所有标本经4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,单个位点显微切割病变组织及其间质,常规方法抽提基因组DNA。(1)巢式PCR扩增位于人类X染色体上的AR基因,PAGE电泳检测病变的克隆性。(2)以通用引物GP5+/GP6+扩增HPVL1区;多重PCR同时扩增HPV16的E2、E6基因,分析HPV16的存在状态。HPV16 E2或E6阳性提示HPV16感染,HPV16 E2/E6比值接近或大于1,为HPV16游离型;HPV16E2/E6比值明显小于1,为HPV16游离、整合混合型;仅为HPV16 E6阳性,为HPV16E6完全整合型。(3)免疫组织化学(Envision法)检测P16在CIN的表达,分析其分布特征。(4)采用SAS8.0软件进行统计分析。结果:本组150例样本中,成功扩增139例,其中纯合子12例,杂合子127例,杂合率91.4%。(1)各组病变单克隆率:对照组为0例、CINⅠ组为26.9%(7/26)、CINⅡ组为51.5%(17/33)、CINⅢ组为82.1%(23/28)、SCC组为85.0%(34/40),单克隆率随CIN病变级别增高而增加(χ~2=16.492,P=0.0003)。(2)各组HPV16阳性病变分别为:对照组2例、CINⅠ组8例、CINⅡ组13例、CINⅢ14例和SCC组29例;其中HPV16E6的整合率分别为:正常组为0、CINⅠ组25%(2/8)、CINⅡ组30.8%(5/13)、CINⅢ组64.3%(9/14)、SCC组79.3%(23/29),HPV16E6基因在各级CIN中的整合率不同,其差别有统计学意义(χ~2=6.747,P=0.034)。HPV16E6基因整合与CIN的单克隆性呈正相关(χ~2=7.768,P=0.0053,r=0.36)(3)P16在CIN病变中表达程度不一,在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中的阳性率分别为69.2%(18/26)、87.9%(29/33)和92.9%(26/28),其差别有显著统计学意义(χ~2=20.1,P＜0.0001)。其中CINⅠ组有50%(13/26)的病变为P16阳性细胞的局灶分布,CINⅡ组有42.5%(14/33)的病变为P16阳性细胞在上皮基底旁连续分布,而CINⅢ组67.9%(19/28)的病变中P16阳性细胞在上皮全层弥漫分布,该分布特征差别有统计学意义(χ~2=21.996,P＜0.001)。SCC组P16阳性率为97.5%(9/40),其中90%(36/40)为P16弥漫阳性。相关分析表明P16在各级CIN中的分布特征与HPV16的整合有关(χ~2=4.36,P=0.037,r=0.37)。结论:(1)单点显微切割克隆性分析结果表明,本组病例中少部分CINⅠ、绝大部分CINⅡ/Ⅲ是单克隆性病变;发现单克隆性特征与CIN分级密切相关,随着CIN由低级别向高级别CIN进展,单克隆性的发生频率增加,提示单克隆性CIN具有肿瘤属性。(2)HPV16E6基因整合与CIN分级相关,提示HPV16病毒癌基因的整合参与CIN的发生与进展,是宫颈SCC早期发生的关键步骤。(3)P16在CIN中表达增高,且呈不同的分布特征,与CIN的分级相关;P16阳性细胞的分布特征与HPV16的整合密切相关,提示P16是对CIN分级和宫颈鳞癌前驱病变生物学评价的有效标志物。