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[目的] 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是冠心病、脑血管疾病等临床疾病重要的前期病理基础。AS发生发展进程重要的危险因素包括血液高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及甘油三酯水平的改变。甲基原薯蓣皂苷(methyl protodioscin,MPD)是从穿龙薯蓣和盾叶薯蓣中提取的甾体皂苷,研究表明MPD可降低血浆总胆固醇含量,通过降低血脂、血液粘稠度、脂质成分来改善高胆固醇血症和AS。本实验在前期研究基础上,拟分析MPD对HepG2高脂细胞内胆固醇流出的影响,并初步分析其抗AS作用机制。 [方法] 1.HepG2高脂细胞模型的建立。人肝癌细胞(HepG2)经胰酶消化处理后贴壁培养24 h,加入游离胆固醇(free cholesterol,FC),浓度分别为30μg/ml、60μg/ml,孵育48 h诱导为HepG2高脂细胞。用4%多聚甲醛固定,0.5%油红O染色,苏木精复染,最后置于显微镜下观察结果。 2.液体闪烁计数法测定HepG2高脂细胞内胆固醇流出率。实验组分对照组、apoA-1组和MPD组,HepG2细胞经消化处理贴壁后,充分混匀0.2μCi[3H]-胆固醇与60μg/ml FC,加入HepG2细胞中作用48 h后,对照组、apoA-1组用DMEM培养基平衡12h,MPD组加入浓度为30μg/ml MPD作用12h,每组各加入10μg/ml apoA-1(MPD组同时再加入30μg/ml MPD)作用12h后收集各组培养基。用0.1 mol/l NaOH裂解细胞,离心收集上清。液体闪烁计数仪测定各组细胞和培养基的cpm值(cpm值为[3H]-胆固醇放射强度,每分钟计数)。胆固醇流出率(%)=培养基内cpm/(培养基内cpm+细胞内cpm)×100。 3.HepG2高脂细胞中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ATP-bindingcassette transporter A1,ABCA1)mRNA表达变化分析。负载胆固醇的HepG2中加入30μg/ml MPD作用24 h后,再加入10μg/ml apoA-1作用12h,提取细胞总RNA。根据ABCA1基因在GeneBank中的序列设计合成引物,逆转录,实时定量PCR检测ABCA1 mRNA水平的变化。 4.HepG2高脂细胞中ABCA1、低密度脂蛋白受体(low-density lipoproteinreceptor,LDLR)和枯草溶菌素转化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin9,PCSK9)蛋白表达分析。实验分FC组、apoA-1组和MPD组,经MPD与apoA-1处理后,裂解各组细胞收集总蛋白,SDS-PAGE电泳、电转移后,加入特异性抗体,Western blot检测ABCA1、LDLR和PCSK9蛋白表达变化。 [结果] 1.油红O染色鉴定HepG2高脂细胞模型。不同浓度的FC作用于HepG2细胞48 h,经0.5%油红O染色后,镜下可观察到HepG2细胞内有红色脂滴,且随着FC浓度增加而增多,FC浓度为60μg/ml时脂滴最明显,继续增加FC浓度,脂滴不再继续增加。 2.液体闪烁计数法测定HepG2细胞内胆固醇流出率。apoA-1组胆固醇流出率为(2.29±0.25)%,MPD处理组胆固醇流出率为(3.13±0.21)%,较apoA-1组增加了(36.6±9.01)%,差异有统计学意义(P<0.01),表明MPD可促进HepG2细胞内胆固醇流出。 3.实时定量PCR检测ABCA1 mRNA变化。实验结果表明,MPD处理组ABCA1 mRNA表达水平比apoA-1组提高了29.7%,差异有统计学意义(P<0.01)。 4.Western blot分析ABCA1、LDLR和PCSK9蛋白的表达。结果显示,MPD处理组ABCA1蛋白水平比apoA-1组增加21.3%,LDLR蛋白水平表达比apoA-1组升高20.1%,PCSK9蛋白水平比apoA-1组降低17.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。 [结论] MPD可促进HepG2高脂细胞内由ABCA1介导的过量胆固醇流出,升高血浆中HDL水平;增加LDLR蛋白表达、降低PCSK蛋白表达,降低血浆中LDL水平,改善动脉粥样硬化。