【摘 要】
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背景脓毒症可诱发人类心肌功能障碍以及心肌结构改变,导致高死亡率和心血管预后不良。人NPPB基因是调节心血管功能的重要基因,其表达异常可影响心功能以及心肌纤维化的进程。然而,该基因是否参与脓毒症心肌结构和功能的调节,目前研究较为缺乏。本研究利用Nppb条件性敲除小鼠模型,研究脓毒症心肌结构和功能损伤的影响因素以及潜在调节机制。方法通过CRISPR/Cas9技术对小鼠心肌Nppb基因进行条件性敲除,得
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背景脓毒症可诱发人类心肌功能障碍以及心肌结构改变,导致高死亡率和心血管预后不良。人NPPB基因是调节心血管功能的重要基因,其表达异常可影响心功能以及心肌纤维化的进程。然而,该基因是否参与脓毒症心肌结构和功能的调节,目前研究较为缺乏。本研究利用Nppb条件性敲除小鼠模型,研究脓毒症心肌结构和功能损伤的影响因素以及潜在调节机制。方法通过CRISPR/Cas9技术对小鼠心肌Nppb基因进行条件性敲除,得到的flox小鼠与Myh6cre/ert2转基因小鼠配繁得到可诱导心肌特异性敲除的小鼠(Nppbfl/fl;Myh6cre/ert2),PCR鉴定基因型并行DNA测序,泰莫西芬诱导敲除flox片段。同龄（8周龄）雄性小鼠按随机数字表法分为以下四组:1.对照盐水组（Con-Na Cl）;2.对照脓毒症组（Con-LPS）;3.敲除盐水组（CKO-Na Cl）;4.敲除脓毒症组（CKO-LPS）。用15mg/kg的LPS按0.1ml/只腹腔注射以诱导脓毒症模型,盐水组则用等量生理盐水腹腔注射;造模后观察各组一般情况,记录5天死亡率并做生存分析;24h内用经胸超声心动图监测评估小鼠心功能的变化;0h、12h和4w分别取材用于HE和Masson染色以观察小鼠心肌结构的改变和胶原沉积情况;ELISA和比色法实验检测造模24h后血清BNP、IL-6、TNF-α水平,以及心肌组织TGF-β1、VE-cadherin和CK表达量;q PCR检测心肌Acta2、Vimentin、Pecam1、Tgfb1、Tgfbr1和Tgfbr2的表达水平;Western blot检测心肌TGF-β1、smad2、p-smad2、Notch1、NICD蛋白的表达量。应用SPSS 25.0和Graph Pad Prism 9.0软件进行数据处理和统计分析,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.DNA鉴定及测序比对结果证实Nppb-CKO小鼠模型构建成功。2.相较于Con-Na Cl组,Con-LPS组小鼠24h时血清BNP水平显著增高,且与CK、IL-6、TNF-α水平呈正相关,超声心动图发现其心肌收缩功能在3h、6h和12h均较基线有所下降,End MT被激活,5天死亡率高达90%,4周后心肌形态学实验观察到幸存小鼠心肌有多处钙化灶,胶原纤维比例显著增高。3.相较于Con-Na Cl组,CKO-Na Cl组小鼠血清BNP水平显著降低,在LPS诱导后的24h后BNP水平未见明显上升,EF在24h内无明显下降,FS在LPS诱导后6h的水平较基线略有下降,End MT被抑制,5天死亡率为25%,与Con-LPS相比有显著改善,造模后4周心肌未见明显病灶或纤维化改变。结论1.Nppb基因心肌条件性敲除对脓毒症小鼠早期心肌收缩力的维持、心肌结构的稳定以及预后的改善起保护性作用;2.Notch1信号通路可能参与了Nppb基因介导End MT调节脓毒症小鼠心肌结构和功能的过程。
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