一、研究背景肺癌是目前全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤,全球每年新增病例达120万例,根据病理学类型,确诊的肺癌中约有80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。65%～70%的NSCLC发现时已属晚期,失去手术机会,因此化疗成为这部分患者的主要治疗方法。目前对NSCLC最有效的药物公认为铂类和20世纪90年代以后的三代新药,然而晚期NSCLC最高的化疗有效率只有20%-40%,中位生存期不足10个月。第3代化疗药物的出现和应用使肺癌的治疗效果有了进一步的提高,但并未取得突破性进展。近年来,多项国际大型临床研究证实辅助化疗能改善完全切除的非小细胞肺癌患者的生存。然而,目前研究的辅助化疗方案仅能使5%-15%的患者在长期生存中获益,更多的患者可能仅承受了化疗药物的毒性。随着对功能性基因组研究的深入,2009年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)年会中提出NSCLC治疗应遵循个体化治疗的原则。所谓个体化治疗是根据肿瘤生物学和药物基因组学的改变进行针对性治疗。这是建立在循证医学基础上,从而在分子、蛋白、基因水平上指导肺癌治疗,是目前肺癌治疗的理想之路。切除修复交叉互补基因1(exsicion repair cross-complementing group1, ERCC1)和核糖核苷酸还原酶M1(ribonucleotide reductase M1, RRM1)为非小细胞肺癌组织中常见标靶,在不同肺癌患者中均有不同程度表达。多项研究表明,ERCC1与RRM1表达状况与铂类及吉西他滨的耐药密切相关。铂类抗癌作用的主要靶点为DNA,通过DNA-Pt-DNA结构形成DNA链内交联、链间交联或通过DNA-Pt-蛋白质形成DNA-蛋白交联,破坏DNA的正常结构,阻碍DNA的模板作用,进而抑制DNA的复制和转录,使增殖迅速的细胞停滞在G2/M期。ERCC1过表达可使停滞在G2/M期损伤的DNA迅速修复,导致其对铂类耐药。吉西他滨是嘧啶类抗代谢药,作用于DNA合成期,通过干扰核糖核苷酸还原酶M1的功能而减少脱氧核苷酸的产生,最终影响DNA合成,RRM1过表达可导致其耐药。由于不同个体肿瘤组织ERCC1和RRM1的表达不同,导致他们对吉西他滨和铂类药物的敏感性不同。因此检测肿瘤组织中ERCC1和RRM1表达可预测患者对GP(吉西他滨+铂类)化疗方案的敏感性,从而指导临床实施个体化化疗,避免耐药患者接受不必要的毒副作用,提高治疗疗效,改善患者预后。当前关于上述两个因子表达水平检测的方法主要有测序、荧光定量PCR及液相芯片技术。蛋白表达水平上的检测常用免疫组化技术。而液相芯片技术的发展及其多通路、高通量和实时数据分析等优点使其在检测基因mRNA水平具有潜在的临床应用价值,目前国内外对非小细胞肺癌靶标对患者生存预后影响的研究中,分子标记物的检测大多是基于单一的免疫组化技术或基因扩增技术,从蛋白水平或基因水平检测分子靶标的表达,并以此为依据将患者分组进行生存预后评估。少有临床研究比较不同检测技术测得的靶标水平表达差异,本研究回顾性纳入我院收治的77例非小细胞肺癌患者,其中入组该研究的42例患者既往同时接受了ERCC1、RRM1表达的免疫组化及液相芯片技术检测,所有77例患者均接受了ERCC1、 RRM1表达的免疫组化检测。本研究拟在探讨不同检测技术测得的ERCC1、RRM1表达差异的同时依据免疫组化测得的ERCCl、RRM1表达状况对患者进行分组,评价ERCC1、 RRM1对患者生存预后的预测作用。二、目的采用免疫组化技术及液相芯片技术同时检测纳入该研究的42例非小细胞肺癌患者组织样本中ERCC1、RRM1蛋白表达水平,探讨不同检测技术测得的ERCC1、RRM1表达差异,使用免疫组化技术对纳入该研究的所有77例非小细胞肺癌患者中ERCC1、RRM1蛋白表达水平,评价ERCC1、RRM1蛋白表达对患者生存预后的预测作用。三、材料和方法1、材料采集海军总医院胸外科2010年6月-2012年9月行手术切除且术后病理证实为非小细胞肺癌的77名患者,所有患者术前均未接受任何针对肿瘤的治疗措施,所有患者术后均采用免疫组化技术测定组织中ERCC1、RRM1表达状况,其中42例患者同时接受两种检测技术的检测。2、方法免疫组化检测：所有标本均经10%中性甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,4μmm切片,常规HE染色。免疫组化染色采用Envision二步法,高温高压抗原修复,3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,一抗室温2h,二抗室温20min,DAB显色,流水冲洗,苏木素复染,常规脱水透明后中性树胶封片。已知阳性切片作为阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化阳性染色呈棕黄色颗粒,ERCC1定位于癌细胞核,RRM1定位于胞质。根据染色程度和染色阳性细胞百分比进行评分。Olympus光学显微镜X400高倍镜下随机挑选5个视野,每个视野记数100个肿瘤细胞,阳性判定标准为记数的肿瘤细胞细胞核或细胞浆中出现棕黄色染色颗粒,最终根据肿瘤细胞染色程度和染色阳性细胞百分比进行评分。染色程度判定标准：基本不着色记0分,胞浆或胞核中出现稀疏的棕色颗粒为1分,出现较多的棕黄色颗粒为记2分,出现弥漫粗大的棕黄色颗粒为3分。将染色程度得分与着色阳性细胞占计数细胞百分比相乘得出H值。H值为0分为阴性(-),0<H值<1为弱阳性(+),1≤H值<2为中度阳性(++),2≤H值<3为强阳性(+++)。液相芯片检测：组织标本经75%乙醇固定,取适量样本加入裂解液,56℃下裂解反应2h,将组织裂解液转移至孵育板上,向样本中加入支持探针-微球,支持延伸探针及缓冲液,55℃震荡孵育后过夜,次日将孵育板放在磁力架上1分钟并加入洗涤液,震荡洗涤1分钟后,将孵育板放在磁力架上1分钟吸取弃去上清液,重复3次,加入扩增延伸探针和标记探针,50℃震荡反应1小时后,将孵育板放在磁力架上1分钟,吸取弃去上清液,用洗涤液洗2次,加入链霉亲和素-藻红蛋白,50℃震荡反应30min,孵育板放在磁力架上1分钟,吸取弃去上清；用洗涤液洗2次,加入洗涤液,震荡5分钟,待测物如ERCC1mRNA或RRM1mRNA在液相反应体系中与分子探针特异性结合后加入荧光标记,经液相悬浮反应后的乳胶颗粒被微量液体传送系统排成单列通过两束激光：一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的性质(定性),另一束测定微粒上荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)。Luminex阅读仪显示为液相芯片微球中位荧光读数,经广州益善生物有限公司提供数据处理软件产生最终结果,根据ERCC1和RRM1表达水平依次分为低表达、中偏低表达、中表达、中偏高表达、高表达(表达程度判定参考益善检测人群数据库)。四、结果经免疫组化检测的42例组织样本中,ERCC1表达结果为(-)30例,(+)8例,(++)3例,(+++)1例；RRM1表达结果为(-)7例,(+)26例,(++)4例,(+++)5例。经液相芯片检测的肿瘤组织中ERCC1低表达21例,中偏低表达18例,中偏高表达2例,高表达1例；RRM1低表达9例,中偏低表达23例,中偏高表达4例,高表达6例。两种检测方法测定的NSCLC中ERCC1、RRM1蛋白及mRNA表达一致率分别为52.3%(22/42)和76.2%(32/42)；两种方法测定的肿瘤组织中RRM1的表达水平有良好的相关性(r=0.793,p=0.01),而ERCC1的表达则无明显相关性(r=0.249,p=0.22)。免疫组化技术及液相芯片技术测定的肿瘤组织中ERCC1表达水平及RRMl表达水平间均无明显相关性(r=0.016, p=0.918; r=-0.074, p=0.642)。采用免疫组化技术对所有77例患者组织样本中ERCC1、RRM1表达水平进行测定后发现,非小细胞肺癌组织样本中ERCC1、RRM1蛋白表达水平与患者各临床病理参数如：性别、年龄、吸烟状况、病理类型、分期、淋巴结转移状况无关。ERCC1阴性表达组术后总生存状况优于ERCC1阳性表达组,统计分析χ2=4.257,P=0.039两组间有显著统计学差异,两组间无进展生存期差异具有显著性(17.3月VS14.3月,P=0.011),但两组间术后平均生存期差异不具有显著性(20.3月VS18.1月,P=0.205)。RRM1阳性表达组术后总生存状况优于RRM1阴性表达组,统计分析χ2=5.948,P=0.015两组间有显著统计学差异,两组间术后平均生存期及无进展生存期差异均不具有显著性(21.5月VS18.3月,P=0.059；16.8月VS15.8月,P=0.396)。五、结论第一部分1、免疫组化技术测定的非小细胞肺癌组织样本中ERCC1蛋白表达水平与液相芯片技术测定的非小细胞肺癌组织样本中ERCC1mRNA表达水平有一定的一致性及相关性。2、免疫组化技术测定的非小细胞肺癌组织样本中RRM1蛋白表达水平与液相芯片技术测定的非小细胞肺癌组织样本中RRM1mRNA表达水平有良好的一致性及相关性。3、液相芯片技术及免疫组化技术同时使用可用于挑选临床优势人群,增强化疗的敏感性及特异性。第二部分1、非小细胞肺癌组织样本中ERCC1蛋白表达水平与患者各临床病理参数如：性别、年龄、吸烟状况、病理类型、分期、淋巴结转移状况无关。2、非小细胞肺癌组织样本中RRM1蛋白表达水平与患者各临床病理参数如：性别、年龄、吸烟状况、病理类型、分期、淋巴结转移状况无关。3、ERCC1阴性表达组术后总生存状况优于ERCC1阳性表达组,统计分析χ2=4.257,P=0.039两组间有显著统计学差异,两组间无进展生存期差异具有显著性(17.3月VS14.3月,P=0.011),但两组间术后平均生存期差异不具有显著性(20.3月VS18.1月,P=0.205)。4、RRM1阳性表达组术后总生存状况优于RRM1阴性表达组,统计分析χ2=5.948,P=0.015两组间有显著统计学差异,两组间术后平均生存期及无进展生存期差异均不具有显著性(21.5月VS18.3月,P=0.059；16.8月VS15.8月,P=0.396)5、ERCC1及RRM1表达状况可作为评估患者生存预后的重要预测因素。