围绝经期及绝经期是女性乳腺癌高发而且恶性程度较高的时期。高卵泡刺激素(FSH)与低雌激素(Estrogen)是这一时期女性体内两大重要的内分泌改变。已知大多数乳腺癌表现出雌激素依赖的特征,高水平的雌激素可以促进乳腺癌的发生发展。然而,围绝经期及绝经期女性体内低雌激素水平,提示这一时期乳腺癌高发而且恶性程度较高与某种或多种非雌激素因素存在着高相关性。围绝经期及绝经期女性体内的高FSH水平提示高FSH很可能对女性乳腺癌高发且恶性程度较高起着前所未知的非常重要的作用。最近在《新英格兰杂志》有一篇文章报道,多种恶性肿瘤组织内血管内皮细胞高表达FSH受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR),反观癌旁非肿瘤组织血管内皮细胞FSHR成低表达形式,表达水平随着血管离肿瘤组织的距离增大而逐渐降低。然而,对于恶性肿瘤组织内血管内皮细胞高表达FSHR的意义,作者未作研究,其意义尚不清楚。此前有文献报道FSH可以通过卵巢癌细胞上的FSHR促进卵巢癌细胞的增殖。肿瘤组织血管内皮细胞上高表达FSHR使我们设想FSH极有可能通过刺激血管内皮细胞上的FSHR对血管的结构和功能产生影响。本研究从临床调查,动物实验,细胞和分子实验三方面,分别对FSHR在乳腺癌血管内皮及正常血管内皮中的表达和分布,FSH刺激血管及血管内皮细胞功能和结构变化的表型,FSHR在血管内皮细胞中偶联的信号途径及其分子机制进行了较为深入的研究。结果发现：1)免疫组化研究显示乳腺癌血管内皮中FSHR的表达远远高于正常血管水平,对常用的血管内皮细胞细胞系脐静脉血管内皮细胞HUVEC采用western-blot及RT-PCR分析发现其表达FSHR;2)条件性乳腺癌细胞培养液以及血管内皮生长因子VEGF可以上调HUVEC中FSHR的表达,而且VEGF能够促进滞留在胞浆中的FSHR迁移至细胞膜；3)单独使用FSH对HUVEC的增殖,迁移,侵袭和血管管腔生成无直接影响,但用VEGF预处理细胞24小时,或采用慢病毒过表达FSHR后,FSH在VEGF作用的基础上可以明显促进HUVEC的增殖,迁移,侵袭和血管形成,及减少细胞间的连接,同时降解连接蛋白的基质金属蛋白酶表达升高；4)在FSHR偶联的信号分子方面,在VEGF存在的条件下,FSH可以激活钙离子内流,促进多种激酶包括AKT和ERK,及转录因子c-fos, c-jun, CREB和SMAD2的磷酸化；5)在裸鼠成瘤实验中,我们将雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系Bcap37植入假手术,去势,去势后再补充FSH的三组裸鼠体内,发现去势组形成的肿瘤质量和体积明显大于假手术组,而去势后补充FSH则肿瘤质量和体积增大最为明显；6)FSH对于Bcap37细胞的增殖没有影响,但对三组裸鼠所成瘤体的石蜡切片进行微血管密度MVD免疫组化分析发现,去势组微血管密度明显高于假手术组,而去势后补充FSH组微血管密度最高；7)临床初步调查结果表明,乳腺癌病人FSH水平与其癌组织中微血管密度呈线性正相关。本文研究表明,血管内皮细胞表达FSHR,但FSH单独对血管内皮细胞无明显作用；在较高水平VEGF存在条件下(如肿瘤细胞可以产生大量VEGF), FSH可以明显增加VEGF调控血管内皮功能的信号途径的活动,同时促进血管内皮细胞增殖,迁移,侵袭和血管形成及促进肿瘤生长。研究结果为围绝经期及绝经期女性乳腺癌高发且恶性程度较高的原因提出了一个新的机制,并为临床乳腺癌治疗提供了一条以降低围绝经期和绝经期FSH水平,抑制肿瘤新生血管形成从而提高肿瘤治疗效率的新途径。第一部分卵泡刺激素受体FSHR在人肿瘤及正常血管内皮细胞中的表达目的：研究卵泡刺激素受体FSHR在人肿瘤及正常组织血管内皮中的表达差异及相关机制。方法：1.对10例乳腺癌病人手术切除乳腺肿瘤组织切片及癌旁正常乳腺组织切片采用免疫组化法检测血管内皮FSHR表达。2.对目前常用的血管内皮细胞系脐静脉内皮细胞采用RT-PCR,Western-blot,免疫荧光及DNA测序检测FSHR的表达及细胞内定位。3.采用雌激素受体阴性乳腺癌细胞系Bcap37细胞培养液及梯度浓度的内血管表皮生长因子VEGF处理HUVEC不同时间后,检测FSHR的表达变化。4.构建FSHR-GFP融合蛋白质粒并转染至HUVEC后,采用转盘式共聚焦显微镜实时定量检测经VEGF处理1小时内,FSHR在HUVEC上的定位变化。结果：1.10例乳腺癌病人手术切除乳腺肿瘤组织切片进行FSHR抗体免疫组化,结果表明肿瘤部位血管内皮FSHR表达明显高于周围正常乳腺组织血管内皮细胞内FSHR。2.目前常用的血管内皮细胞系脐静脉内皮细胞内有FSHR表达。3.Bcap37细胞培养液及梯度浓度的VEGF可以上调HUVEC中FSHR的表达,VEGF通过ERK通路调节FSHR的表达。4.VEGF可以促进FSHR从HUVEC胞浆中转移至细胞膜上。结论：人乳腺癌组织内血管内皮细胞FSHR表达水平高与周围正常组织内血管内FSHR水平,造成这种差异的原因是由周边肿瘤细胞释放血管表皮生长因子VEGF促进了FSHR在血管内皮中的表达；同时,VEGF可以促进FSHR从HUVEC胞浆中转移至细胞膜上。第二部分卵泡刺激素FSH对乳腺癌血管发生的作用研究目的：应用细胞和裸鼠模型研究FSH对于乳腺癌血管发生的作用。方法：本实验通过细胞和动物模型两部分进行；1.细胞水平：FSH处理脐静脉内皮细胞(HUVEC),1)采用MTT法研究FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC增殖活力的作用；2)采用transwell法研究FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC侵袭能力的作用；3)采用愈伤实验研究FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC迁移能力的作用；4)采用Western-blot技术研究FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC表达基质金属蛋白酶的作用5)采用免疫荧光方法检测FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对于骨架蛋白F-actin重构的作用；6)采用tube formation法检测FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC形成血管腔能力的作用；7)采用电镜及免疫荧光法研究FSH在有VEGF或无VEGF预处理后对HUVEC胞间连接的作用2.动物实验：1)将Bcap37细胞植入假手术组(shame),去势组(OVX)及去势后每天注射FSH组(OVX+FSH),在60天左右的时间内,检测肿瘤瘤体体积及重量的变化；2)采用MTT法研究FSH对于Bcap37细胞增殖活力的作用；3)采用血管内皮标志物CD31对裸鼠肿瘤切片进行免疫组化,检测不同组微血管密度(microvessel density)的差异。3.临床调查：初步收集17例乳腺癌病人术前FSH和雌激素检测数据,并对手术切除癌组织行CD31免疫组化,微血管密度(image pluo plus计算法)分析。采用spss16.0软件分析FSH水平与MVD相关性。结果：1.细胞实验：单独采用FSH处理HUVEC,观察FSH对HUVEC增殖,侵袭,迁移,释放基质金属蛋白酶,胞间连接和管腔形成能力没有影响。用VEGF预处理24h或过表达FSHR后,发现FSH可以显著促进HUVEC的增殖,迁移,骨架蛋白F-actin的重构和血管形成；采用慢病毒干扰HUVEC中FSHR的表达后再加VEGF处理24小时后,发现FSH对HUVEC增殖无影响。2.动物实验：不同组裸鼠成瘤并饲养60天后,发现去势组成瘤大小,体积明显高于假手术组,而去势后继续注射FSH组最高；FSH对于Bcap37细胞的增殖没有影响,但对三组裸鼠所成瘤体石蜡切片进行微血管密度MVD免疫组化结果表明,去势组微血管密度明显高于假手术组,而去势后继续注射FSH组微血管密度最高。FSH对Bcap37细胞合成VEGF没有影响。3.临床调查：临床初步调查结果表明,乳腺癌病人FSH水平与其癌组织中微血管密度呈正相关,R2=0.624。结论：通过VEGF上调并转移到血管内皮细胞膜上的FSHR,FSH可以促进肿瘤血管的形成,并进而促进肿瘤的发展。第三部分卵泡刺激素FSH对血管发生的作用的机制研究目的：检测FSH促进血管生成所通过的信号通路。方法：通过VEGF处理后或过表达FSHR后,加FSH处理HUVEC,采用荧光实时定量测钙系统检测钙离子的内流,采用western-blot技术检测FSH对于重要信号通路蛋白,如AKT,ERK等的磷酸化变化。结果：1)FSH可以促进VEGF预处理或过表达FSHR的HUVEC的钙离子的内流,而对于未经过VEGF处理或转染空载体组没有HUVEC没有影响；2)对未经任何处理的HUVEC,FSH不会激活重要激酶或转录因子,或激活程度较低,当VEGF预处理HUVEC24小时后,FSH可以较强烈激活重要激酶或转录因子。结论：FSH可以介导VEGF激活多条信号通路而促进新生血管生成。