糖尿病已经成为现代生活中威胁人类健康、影响人们生活的主要疾病，而视网膜新生血管是糖尿病患者致盲的首要原因。糖尿病视网膜病变（DR）典型的临床体征是动脉瘤形成，新生血管形成，玻璃体积血，网膜前增殖膜形成，视网膜脱离等。而在DR早期，视网膜各层血管的周细胞，血管内皮细胞，神经节细胞以及Muller细胞等主要病变是发生细胞凋亡。DR的发病尤其早期病变以神经胶质细胞的激活、炎症因子的表达增加和白细胞粘附到视网膜的血管壁、神经元的凋亡和死亡等病变为主。目前针对DR的研究热点是从炎症、神经元细胞和视网膜血管等病变角度深入开展。关于DR的成膜方法较多，但普遍都需要比较长的时间，由于缺血再灌注IR损伤也以上述病变为主，因此我们采用相对快速的IR模型，寻找DR的治疗靶点和病理损伤研究及治疗的新理念。我们采用IR损伤模型复制DR的主要病理损伤，用IR来替代DR进行某些病理机制和新治疗靶点筛选的研究。IR是造成视网膜一定时间的缺血后再去除损伤因素，血流再次返流灌注视网膜血管造成的损伤过程。IR损伤主要由于活性氧自由基和炎症前因子的改变，导致神经细胞和血管的损伤。视网膜的IR损伤模型是研究氧自由基和视网膜炎症的很有价值的方法，在评价各种因子对于视网膜损伤的保护作用也很有价值。我们分别建立两种动物模型并对比小鼠的IR和DR模型的特征性病理变化，证实两种模型在血管和神经损伤的病理改变极为相似，因此考虑在一定程度上可以应用快速模型IR来复制DR的病理变化。在IR损伤中，发现TSP1是早期升高的一个重要因子，而且TSP1作为内源性抑制新生血管的因子被大家熟知。因此我们采用动物体内试验和细胞体外试验比较WT和TSP1KO在IR模型造成的损害，发现TSP1可以诱导血管和神经细胞凋亡、促进炎症发生、增加氧自由基的损害、白细胞粘附、破坏血视网膜屏障。结果可以为评价TSP1在DR中的作用提供依据。1、成功的用腹腔注射STZ方法建立了糖尿病鼠模型。并对病程2-6个月的小鼠进行了针对炎症因子、血管内皮细胞、神经节细胞凋亡、白细胞粘附功能、血视网膜屏障功能、氧化损伤等病理变化的研究。我们通过不同剂量组的比较，发现C57BL6小鼠腹腔注射45mg/Kg的STZ，每天相同时间连续注射5天成功建立稳定、理想的糖尿病鼠模型。对不同时期的视网膜神经细胞丢失、无核毛细血管的计数、白细胞粘附和浸润以及血视网膜屏障功能的测定结果显示，这些病变属慢性过程，随着病情的进展，病理改变逐渐加重。注射STZ2个月的小鼠视网膜的TSP1在mRNA水平表达升高约1倍，说明TSP1在DR的发病过程中发挥作用。为了研究TSP1在DR起到什么作用，我们拟采用IR复制DR病理改变，并用TSP1KO小鼠建立模型进行深入研究。2、成功用前房灌注升高眼压方法建立缺血再灌注模型。并对模型小鼠进行了针对炎症因子、血管内皮细胞、神经节细胞凋亡、白细胞粘附功能、血视网膜屏障功能、氧化损伤等病理变化的研究，比较在DR模型中的病理变化。发现二者在上述各方面病理损伤结局高度相似。并且TSP1在诱导凋亡、炎症损伤、氧化损伤等过程发挥了重要作用。发现给予小鼠眼球90mmHg的灌注压，持续90分钟的视网膜IR模型稳定，并可复制DR的神经细胞的退变、无核毛细血管的形成、白细胞粘附、白细胞浸润、血视网膜屏障破坏等损伤性病理改变。视网膜IR模型的炎症因子和凋亡细胞明显增加，认为在此过程的炎症和凋亡机制发挥损伤作用。TSP1敲除小鼠的神经细胞退变、无核毛细血管形成较对照组明显减少，而白细胞粘附和浸润以及血视网膜屏障较对照组无明显变化或稍加重。说明TSP1在IR损伤中以促进凋亡机制为主，而在诱导炎症的过程中的机制有待深入研究。确定野生型小鼠IR损伤的一个重要路径是通过激活P38路径、NFκB路径，进而激活CD95L，导致caspase8和caspase3的相继活化，诱导凋亡产生。为了进一步证明TSP1在视网膜IR模型中的促进凋亡作用，我们模拟IR损伤的缺血、缺氧再恢复供血、供氧的过程，以培养的人视网膜内皮细胞建立IR的体外模型。发现应用siRNA技术去除TSP1的表达，内皮细胞凋亡减少，并且对于高糖的耐受性较好。3、我们进一步培养HREC细胞，由于其来源于血管内皮，能够进一步证明TSP1对于血管内皮的作用。首先我们建立IR的体外模型，通过将HREC放入1%的低氧氧箱，再放入正常氧含量的细胞培养箱。低氧4小时后，再放于正常氧环境24小时，低氧对于细胞凋亡的诱导为正常氧对照组的3倍，TSP1的蛋白水平也升高到对照组的2倍。说明TSP1在IR诱导后早期表达即升高，并且可能同时具有诱导细胞凋亡的作用。我们应用转染siTSP1细胞观察其凋亡变化，发现没有TSP1的作用，4小时低氧后再24小时正常氧的细胞凋亡转染siCN组减少了30%，进一步证明TSP1在诱导细胞凋亡方面有重要的作用。通过对于caspase3的活性测定，发现转染siTSP1组较对照组凋亡减少35%。证明去除TSP1的作用后，从凋亡前的反应到诱导凋亡的发生都明显减少。高糖诱导HREC，制作DR的体外模型。我们将培养的HREC分成对照组和不同浓度葡萄糖组，发现随着血糖升高，caspase3活性相应增高，说明高糖可以诱导HREC凋亡。为了研究TSP1在高血糖情况下对于细胞凋亡的作用，我们应用转染siTSP1方法，干涉掉细胞内的TSP1的表达，发现TSP1KO的高血糖组较TSP1CN对照组细胞凋亡降低15%，认为TSP1对于高糖作用下的细胞凋亡具有保护作用。本文通过建立STZ的糖尿病小鼠模型和高眼压造成的IR模型，比较二者病理变化，发现DR和IR在病理损伤结局有较多高度的相似处，而且IR成膜快，认为IR可以在寻找DR发病的机制，影响因素，治疗DR的新靶点等过程中，作为相对快速模型一定程度上替代DR模型。在研究中我们发现TSP1在IR损伤早期升高，进而发现TSP1在诱导细胞凋亡、炎症因子变化、氧化损伤、白细胞粘附、浸润、血管通透性方面有很重要的作用。进而利用HREC建立IR的体外模型，进一步印证了TSP1通过调节caspase3活性诱导凋亡，并可以与TNF协同作用，诱导凋亡和炎症反应。并且，TSP1可以增加高糖状态下的HREC凋亡。因此，我们认为TSP1可能为DR的机制研究和治疗提供新的思路和方向。