南极磷虾蛋白酶和脂肪酶的分离纯化及性质研究

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南极磷虾(Euphausia Superba)是一种生活在南极海域的甲壳类浮游动物,是目前已认知最大的单种可捕捞利用的海洋渔业资源,具有打造我国第二个远洋渔业的潜力,积极参与南极磷虾资源开发,对促进我国极地渔业发展以及培育海洋生物新兴产业具有重大的战略意义。南极磷虾含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、羧肽酶、纤维素酶等多种活性酶,由于南极海域水温低,南极磷虾酶多具有较为优异的低温催化活性,在食品、医药等领域具有很好的应用前景。本论文对南极磷虾粗酶液中蛋白酶的基础酶学性质进行了研究,开发了蛋白酶的抑制剂;从南极磷虾体内分离纯化出一种新型脂肪酶,研究了其酶学性质,测定了其催化能力。本文章分三部分:(1)南极磷虾粗酶液中蛋白酶的基础酶学性质研究及抑制剂的开发本研究探讨了反应温度、pH、金属离子(Zn2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Ca2+)对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的影响,研究了苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA·2Na、碘乙酰胺(IAM)和甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对蛋白酶活性的抑制效果。研究表明,南极磷虾粗酶液中胰蛋白酶的最适反应温度为40℃和最适反应pH值为8.0;当Zn2+在终0.5 mmol/L时对酶的抑制作用最好,抑制率为55.02%;Ca2+离子对南极磷虾粗酶液中蛋白酶有很好的激活作用;PMSF的浓度为8.0mmol/L时对蛋白酶的抑制效果最好,抑制率为60%;抑制剂IAM在加入终浓度在0-2.5 mmol/L之间随加入终浓度的不断增大,抑制效果不断增强,在浓度为2.5mmol/L时抑制效果达到最大,抑制率66.67%;TPCK对酶活抑制效果较差,在0-8.4mmol/L浓度范围内对南极磷虾粗酶液中蛋白酶无抑制作用,当浓度升高至15mmol/L有轻微的抑制作用。EDTA·2Na浓度为0.6 mmol/L时,对蛋白酶的抑制效果最好,抑制率为86.67%,在5-30℃范围内,随着温度的增大,EDTA·2Na对酶活的抑制效果逐渐增大,在30℃时,抑制率达85.02%。(2)南极磷虾新型脂肪酶的分离纯化综合利用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE离子交换层析、分子排阻色谱层析等方法建立了南极磷虾中新型脂肪酶的纯化工艺技术路线,从南极磷虾体内分离出新型脂肪酶,其纯化倍数为22.4,酶活回收率为5.2%,SDS-PAGE电泳条带显示为单一条带,分子量为71.27KDa。(3)南极磷虾新型脂肪酶酶学性质的研究研究温度、pH、金属离子、糖类、有机溶剂、表面活性剂对新型南极磷虾脂肪酶基础酶学性质的影响,得到该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0,Ca2+和Mg2+分别在0-0.5mmol/L和0-0.3mmol/L浓度范围内对脂肪酶活有激活作用,随离子浓度增大,Mg2+对酶活具有抑制作用,Fe3+和Cu2+对酶活具有显著的抑制作用,当离子浓度为0.5mmol/L时,抑制率分别为71.79%和53.33%。在南极磷虾脂肪酶中添加6%的蔗糖溶液对酶活具有保护作用;EDTA和SDS在添加终浓度在1mM时对酶活具有保护作用,吐温20在添加终浓度为1%时对酶有保护作用。通过研究脂肪酶的底物特异性发现,脂肪酶对于侧链长度不同的对硝基苯酯(C4-C16)具有不同的水解活性,其中对底物对硝苯酚辛酸酯(C8)的水解活性最好。以对硝基苯酚月桂酸酯为底物时测的酶的Vmax为2.4U/mg,Km为3.27mM。通过实验得到了南极磷虾粗酶液中蛋白酶的最佳抑制剂为EDTA·2Na,而且建立了南极磷虾新型脂肪酶的纯化工艺路线,并对酶的基础酶学性质和催化性能进行了研究,为南极磷虾的开发和多元利用提供了理论和数据支撑。
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