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工业革命以来，随着人类经济的发展，生物赖以生存的环境发生了巨大的变化。热岛效应、温室效应、环境污染、土壤的盐碱化和耕地的荒漠化等现象对农作物、经济植物和植被植物的生长发育产生了严重的逆境胁迫作用。其中气候的变化是妨碍植物生长的一个重要的限制因子，突发的低温冷害和冻害严重妨碍许多经济植物尤其是热带型植物的生长。用生物工程技术开发抗逆的植物种质新材料不仅具有十分重要的社会意义，而且已经成为当代生物工程研究和植物改良领域的一大热点，基因工程等微观的技术手段和宏观的生态学原理相结合正在成为研究的新领域。本研究拟通过生物工程技术包括分子克隆技术和转基因技术改良植物材料的抗逆性遗传特性，力图探索其基因表达调控途径的机理，改善其抵抗低温胁迫的能力，缓解城市胁迫对植物分布、生长发育和经济效益等带来的不利影响，改善生态环境。 植物对低温、干旱胁迫有一定的适应性和抵抗能力，这种抗逆性受系统进化的遗传基因型所控制，本文通过基因工程手段在十字花科植物葬菜命刀se了1abu~下户己stor了s中克隆得到了新的抗冻关键基因cbc口厂了肋基因及其上游的转录激活因子幼cb式及伪cbf上游转录因子cbice53，和其它冷适应相关调节因子必乙0520证明在莽菜中存在ICEI通过与CBF启动子部分相结合激活其表达，进而CBF又通过结合抗冻基因启动子部分带有的顺势式作用元件CRT/DRE从而促进抗冻基因表达，提高植物抗冻性的基因表达调控途径，及其它相关转录因子相互作用的级联机制。并构建CamV35S组成型表达启动子驱动COR基因表达的单价植物表达载体l(即PCamV35S一cbcor了肋cds一T Nos)，同时构建CBF十cor调节表达的两种植物表达载体2，3(即P CamV35S一必ebfCdS一T NoS，P Cold一induCed promoter一Cbcorl砧，cds一T NoS)，并将1、3基因表达的单价载体平行转化烟草，2、3共转化烟草。以期筛选获得抗冷性有较大提高的转基因后代，比较和探讨植物抗冷胁迫的表达机理。 本文中基因克隆均采用RACE一PCR同源克隆技术。从葬菜中克隆得到了一个新的抗冻基因助eor15b(基因bank登录号:AY437888)全长eDNA为588bp，含有一个417bp的开放阅读框(ORF)，编码一个有139个氨基酸的蛋白质。同源比较表明CbCOR15B和许多其它COR15蛋白及LEA(late embryogenesiS abundant)蛋白有很高的同源性。蛋白功能位点分析表明CbCOR15B有一个潜在的叶绿体信号剪切位点和两个依赖于腺普酸和鸟营酸的蛋白激酶磷酸化作用位点(eAMp一and eGMp一dependent protesnkinase(pKA and pKG)vhosphorylation、ites)。二级结构和三级结构分析表明CbCOR15B具有许多其他COR15家族的共同特征。半定量RT一PCR分析显示cbcor15b的 友.夏大学博d二学位论文表达受低温诱导。所有的分析结果表明Cbcorl砧可能具有和其它cor基因一样的增加植物抗冻性的功能。 本文克隆得到了葬菜cbcor了5b转录激活因子cbcb式基因bank登录号:AY391121)全长cOM为IO34bp，含有一个657bp的开放阅读框(ORF)，预测编码一个219个氨基酸的DRE/CRT的结合蛋白质。预测的CbCBF蛋白包括一个潜在的核定位序列(NLS)在N端，紧跟着一个APZ DNA结合基元和一个酸性的C端可能充当激活结构域。生物信息学分析显示cbcbf与其它的CBF基因十分相似。冷适应分析表明cbcbf的表达是受冷诱导的。所有的分析结果表明Cbcb厂可能同其它的CBF基因具有相同的功能例如通过激活下游抗冻基因的表达提高植物的抗冻性。 本研究在葬菜还得到了一个新的尤万了基因(基因bank登录号:AY506804)，该基因(cbz’co53)全长CDNA为18llbp，含有一个1476bp的开放阅读框(ORF)，预测编码一个492个氨基酸的蛋白。预测的Cb工CE53蛋白包括一个潜在的螺旋一环一螺旋结构，一个核定位序列(NLS)和几个其它的结构域。生物信息学分析显示cb了ce53与拟南芥的了艺万Z基因十分相似。非生物胁迫分析及冷适应分析表明cb了ce53的表达与冷诱导和盐诱导相关，并且受ABA的诱导，与干旱诱导不相关。 本研究在算菜中克隆了一个新的冷相关基因转录调节因子cblo￡2。(基因bank登录号: AY559OSO)全长cDNA为1694bp，含有一个1332bp的开放阅读框(ORF)，编码一个有444个氨基酸的蛋白质。预测的C匕LOSZ蛋白包括一个烯醇酶N端结构域和一个烯醇酶结构域，并且象拟南芥的LOSZ蛋白一样具有保守的推定的DNA结合域和阻抑结构域。生物信息学分析表明C匕LOSZ和拟南芥中的LOSZ蛋白及其它烯醇酶 (enolase)蛋白有很高的同源性。冷适应分析显示cbjosZ是组成性表达的，并确实和冷适应过程相关，因此CbLOSZ是一个具有双功能的烯醇酶。 通过以上莽菜中4条新的与冷胁迫相关的基因及其转录因子的克隆和特征功能分析，证明莽菜中存在cbcoI’了5b、cbcb八cb了ce53、命乙052等与冷胁迫相关的基因，且它们的表达都是受冷条件诱导的。其中必了ce53、‘况052是组成性表达，其表达量随冷诱导时间呈轻微上调趋势。Cbice53的表达同时还受盐及ABA的诱导。证明了在葬菜中存在cbjce53激活Cbcbf的?