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固有免疫系统是机体抵御各种病原体入侵的第一道防线。固有免疫系统发挥重要作用的关键之一是存在种系编码(germ-line encoded)的模式识别受体(pathogen recognition receptors,PRRs),PRRs能够识别多种“非己”异物共同表达的分子,即病原相关分子模式(pattern associated molecular patterns,PAMPs)。RIG-I就是一种位于细胞质中、能够识别病毒5ppp-ssRNA(5-triphosphatesingle-stranded RNA)和短的dsRNA(double-stranded RNA)的PRR。RIG-I与配体结合后,相继导致下游一系列分子如MAVS、TRAF3和TBK1的活化,最终激活IRF3和IRF7,从而诱导Ⅰ型干扰素和干扰素调节基因(interferonstimulated genes,ISGs)的大量表达,建立机体的抗病毒反应。
本研究通过同源克隆和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术获得了鲤RIG-I病毒识别受体途径中的4个关键分子RIG-I、MAVS、TRAF3和TBK1的全长cDNA,并进行了分子结构和进化分析,结果如下:1)鲤RIG-IcDNA全长为3378bp,编码946个氨基酸,结构域组成与哺乳类RIG-I一致,从氨基端到羧基端分别为两个CARD结构域(Caspase activation and recruitmentdomain)、一个DExD/H(DEAD-like helicases superfamily)、一个HELICc(helicasesuperfamily c-terminal domain)结构域和一个短的RD结构域(repressor/regulatorydomain)。2)鲤MAVS cDNA全长为3375bp,编码585个氨基酸,氨基端具有一个CARD结构域,中间具有富含脯氨酸的区域。羧基端具有一个短的跨膜区。另外,我们还获得了一个MAVS异构体,MAVS异构体氨基端缺少CARD结构域。鲤MAVS与其他物种的MAVS氨基酸序列一致性程度低。3)鲤TRAF3 cDNA全长为2916bp,编码573个氨基酸,从氨基端向羧基端分别为一个RING(really interesting new gene)结构域、两个锌指结构、一个coiled coil和一个MATH(meprin and TRAF-C homology)结构域。鲤TRAF3与其他物种的TRAF3氨基酸序列一致性程度高。4)鲤TBK1 cDNA全长为2622bp,编码727个氨基酸,氨基端具有一个保守的S_TKc结构域(Serine/Threonineprotein kinases,catalytic domain)。鲤TBK1与其他物种的TBK1氨基酸序列一致性程度高。系统进化分析显示,鲤RIG-I、MAVS、TRAF3和TBK1均与其他鱼类的同源分子聚为一支。
通过荧光定量PCR技术分析了RIG-I、MAVS、TRAF3和TBK1 mRNA在健康鲤鱼多种组织中的表达情况。这些基因在所有被检测组织中均有表达,其中,RIG-I mRNA在肝脏和血液表达较高,其次是脾脏、胸腺和皮肤,在头肾中最低;MAVS mRNA在不同组织中的表达差别较大,在小肠、肝脏和肾脏中表达较高,其次是脾脏、血液、胸腺和脑,在鳃中表达最低;TRAF3 mRNA在血液中表达最高,其次是肝脏和脾脏,在鳃中表达最低;TBK1 mRNA的组织表达情况与TRAF3相似,在肝脏和血液中表达较高,其次是脾脏和胸腺,在鳃中最低。
通过荧光定量PCR技术分析了在SVCV(spring viraemia of carp virus,SVCV,鲤鱼春季病毒血症病毒,简称鲤春病毒)诱导条件下,鲤RIG-I、MAVS、TRAF3、TBK1、IRF3和IRF7 mRNA在脾脏、头肾和小肠中的表达变化情况。RIG-I、MAVS、IRF3和IRF7在脾脏、头肾和小肠中都有明显的上调表达,其中,这些基因在小肠中上调幅度最大,其次是头肾,在脾脏中最小。TRAF3和TBK1头肾和小肠中都有不同程度上调表达,但上调幅度比其他基因要小很多;而TRAF3和TBK1在脾脏中没有明显的上调表达。
以上结果提示,在鲤鱼感染SVCV条件下,特别是在小肠组织中,IRF-3/7的上调表达模式与RIG-I/MAVS/TRAF3/TBK1的上调表达模式基本一致,RIG-I识别病毒后可能能够通过MAVS/TRAF3/TBK1信号途径激活抗病毒反应。