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丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）基因组编码两个包膜（Envelope，E）糖蛋白：E1和E2。E1和E2都是高度N-糖基化的糖蛋白。病毒糖蛋白上的糖链是机体细胞识别、结合的靶分子，并且具有对糖蛋白结构调节的特性。病毒的糖链还具有保护、稳定病毒结构的完整性以及形成屏障以抵御外物的侵入的功能。N-糖基化有很多作用，如影响免疫分子的折叠、成熟、包装、投送、定位以及稳定，影响T细胞的功能，影响体液免疫的功能，对体液免疫和细胞免疫应答强弱的调节等，然而，N-糖基化作用对HCV感染机体的影响却知之甚少。为了研究HCV E2糖基化是否会影响病毒蛋白的合成、装配，以及它对机体免疫应答的作用，本文利用定点突变的PCR技术构建E2的三个重要的糖基化位点的突变体，N177NT，N193ST，N177NT／N193ST，采用高保真性的pfx DNA polymerase进行定点突变，使AAC编码的天冬酰氨（-Asn-）突变为TAC编码的酪氨酸（-Tyr-），使得N-糖基化位点-NNT-，-NST-突变为-YNT-，-YST-。 我们用野生型E2以及糖基化位点突变型E2的DNA作为DNA疫苗来进行进一步研究，由于DNA疫苗研究中共同存在的一个问题是免疫持续时间有限，为了维持理想的免疫效果，需要重复注射DNA或者辅以佐剂。本研究使用丙型肝炎包膜糖蛋白E2的野生型以及不同的糖基化位点突变体E2的DNA（100μg／100μl／只）对BalB／C小鼠进行DNA免疫注射，并设立生理盐水空白对照组，以及空载体pcDNA3.1（-）阴性对照组，单独或联合注射佐剂IL-2。注射部位为小鼠双侧后腿股四头肌内侧，总共免疫三次，每次间隔十天，根据已有的文献报道，HCV包膜糖蛋白E2对小鼠的免疫是在初次免疫后50天左右进入抗体产生的高峰，所以，本实验在末次免疫之后的四周，取小鼠眼球静脉血，用间接ELISA方法检测免疫实验动物体内特异性抗体产生情况以及产生抗体的滴度水平；收集的静脉血经过肝素抗凝之后，用流式细胞仪（flow cytometer，FCM）检测免疫小鼠外周血中CD4+，CD8+T淋巴细胞的变化；无菌取小鼠脾脏，并于37℃，5％CO2培养，收集经过ConA（10mg／ml）诱导的脾细胞培养72小时的上清液，分别用小鼠IFN-γ和IL-4检测试剂盒测定上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平并进行比较;为了初步探索EZ的糖基化与分子伴侣之间的相互关系，分别将野生型和不同的突变型EZ和内质网分子伴侣钙联蛋日（calnexin，CNX）的重组DNA共转染真核细胞Hela，用激光显微共聚焦（eo响eal laser mieroseopy）来观察它们在细胞内的定位。 研究结果显示，我们成功构建两个单位点突变体以及一个双位点突变体;并将野生型EZ连接到原核表达载体pGEX一KG上，并且将野生型/突变型 EZ连接到真核表达载体peDNA3 .l（一）侧yc一HisB上;免疫小鼠的实验结果表明，野生型以及糖基化位点突变型EZ能够诱导特异性的体液免疫，产生特异性的抗体，抗体滴度水平不一致，从1:100一1:800，其中N193ST（EZ一MZ）在免疫应答方面相对于野生型及其他的突变体不仅仅是引起血清转阳率的降低，而且IgG抗体水平也显著下降;发现了突变型及野生型EZ都能引起小鼠CD4+T细胞数量的增加，但是EZ一MZ所引起的CD4+T细胞数量的增加也低于其他的组别，各组之间对CDS+T细胞数量的影响并无显著差异;并对脾细胞分泌上清中细胞因子的水平进行比较，发现DNA免疫组能刺激IFN一Y的分泌，水平较对照组别高，差异有显著性，EZ一MZ引起的改变也略微低于其他实验组，而IL一4的分泌水平的结果显示各组别之间没有明显差异，这初步显示，DNA疫苗诱导Thl型占优势的细胞免疫应答;将野生型以及突变型EZ与CNX共同转染Hela细胞的结果显示，E2和CNX在内质网中能够共表达和共定位，提示了两者之间的相互作用。 本研究结果首次揭示了HCV包膜糖蛋白EZ的糖基化在机体对病毒的免疫应答中起到非常重要的作用，尤其是EZ抗原中的N193ST糖基化位点是B细胞和CD4+T细胞识别的重要的糖特异性抗原表位，此糖基化位点的糖链可能通过影响EZ的空间构型从而对EZ的体液免疫和细胞免疫产生影响:仅改变一个位点就未能或仅能引起较低的抗体水平、仅能刺激CD4+T数量的轻微增加、对I刚令的影响也低于其他实验组;本研究同时也表明，蛋白糖基化与免疫系统有着密切的关系，为病毒感染引起免疫应答改变的分子机制提供了非常重要的线索，为进一步阐明HCV包膜糖蛋白的功能以及HCV新型疫苗的研究奠定了基石出。