巨自噬(以下统称为自噬)是维持细胞内动态平衡的一种基本生理过程,它通过降解一些错误折叠的蛋白质以及衰老损伤的细胞器使得细胞能够抵抗饥饿与药物损伤等外界刺激。自噬与神经退行性疾病、心血管疾病以及肿瘤等诸多疾病密切相关。自噬体与溶酶体的融合是自噬通路中的一个重要环节,自噬底物最终通过溶酶体内的酸性水解酶进行降解,因此溶酶体的生成对于自噬过程至关重要。microRNA(miRNA)是一类内源性的小分子非编码RNA,其长度约为22个核苷酸,能够通过多种作用机制参与调控人体内60%以上的基因。近年来,有诸多研究发现miRNA能够通过靶向于不同的自噬溶酶体相关基因调节自噬过程,但是在这些研究中miRNA均是在细胞质中通过经典的分子机制发挥作用,对于细胞核中miRNA的作用几乎没有研究。本课题旨在探索miR-30b-5p与miR-148a-3p分别通过细胞核与细胞质内的不同作用方式调控溶酶体的生成与自噬过程,为阐述miRNAs新的作用机制以及治疗自噬异常相关疾病提供了新的思路。1.细胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介导的溶酶体生成及自噬:(1)miR-30b-5p可以与CLEAR元件直接结合:首先,通过pull-down实验与sRNA-seq发现miR-30b-5p可以与CLEAR元件直接结合。随后的荧光素酶报告基因实验结果显示miR-30b-5p能够抑制CLEAR元件的荧光素酶活性,EMSA实验发现miR-30b-5p可以抑制CLEAR元件与细胞核蛋白的结合。(2)miR-30b-5p能够通过CLEAR元件与溶酶体相关基因的启动子区相结合并抑制其转录:通过荧光素酶报告基因实验发现miR-30b-5p能够抑制CTSA、CTSD、MCOLN1与LAMP2等溶酶体相关基因的荧光素酶活性,而突变之后的miR-30b-5p失去了抑制作用。(3)miR-30b-5p能够在细胞核内抑制TFEB的转录活性:FISH与qPCR实验结果显示,miR-30b-5p在细胞核中有分布,并且在细胞饥饿状态下转运入核增加。随后的ChIP实验结果显示,miR-30b-5p能够抑制转录因子TFEB和RNA聚合酶II与溶酶体相关基因启动子区的结合。(4)miR-30b-5p抑制溶酶体相关基因的表达:蛋白质谱分析、qPCR与蛋白质免疫印记(WB)等实验结果显示miR-30b-5p能够抑制大多数溶酶体相关基因的表达。免疫荧光实验结果显示,miR-30b-5p可以抑制溶酶体标志物蛋白LAMP1的表达。另外,我们还探索了miR-30b-5p对于溶酶体示踪剂Lysotracker的影响,结果与免疫荧光实验一致。将介导成熟miRNAs入核的核转运蛋白Importin 8敲低之后,miR-30b-5p失去了对于溶酶体相关基因的抑制作用,这一结果为miR-30b-5p在细胞核中发挥作用提供了关键证据。(5)miR-30b-5p对于自噬体生成与自噬流的抑制作用:蛋白质免疫印记(WB)实验结果显示,miR-30b-5p可以使得自噬体标志物LC3 II的表达降低,自噬底物SQSTM1的降解减少。接下来,miR-30b-5p与EGFP-mCherry-LC3质粒被共同转染进HEK293细胞中以检测其对自噬流的影响。结果发现,miR-30b-5p对于自噬体的生成以及自噬体与溶酶体的融合过程均有抑制作用。通过CRISPR/CAS9技术对miR-30b-5p进行敲除之后发现,溶酶体相关基因的mRNA水平、蛋白水平以及荧光素酶活性都有一定程度的上调。(6)在小鼠肝脏中miR-30b-5p对于自噬溶酶体的调节作用:将小鼠进行饥饿处理48h之后,发现肝脏是自噬水平增高最为明显的脏器。因此,我们着重考察了miR-30b-5p对肝脏自噬的调节作用。将含有pri-miR-30b-5p的AAV通过尾静脉注射的方式注入小鼠体内,9周之后对小鼠进行了饥饿处理48h,然后将其肝脏取出进行分析。分析结果显示,在miR-30b-5p处理的小鼠肝脏中,溶酶体生成以及自噬水平都有所降低。2.miR-148a-3p通过直接与CTSA结合而抑制自噬:(1)miR-148a-3p能够直接与CTSA的3’端UTR区结合并抑制其荧光素酶活性:TargetScan数据库预测发现,miR-148a-3p的5’端种子序列与CTSA的3’端UTR区具有8个碱基的匹配。随后我们将miR-148a-3p的3’端UTR区连接到psiCHECK-2质粒中,构建了荧光素酶报告基因表达体系。荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-148a-3p能够抑制CTSA mRNA的3’端UTR的荧光素酶活性。(2)miR-148a-3p能够抑制CTSA的蛋白及mRNA水平:通过qPCR实验与蛋白免疫印记(WB)实验发现,miR-148a-3p能够显著抑制CTSA的mRNA及蛋白水平。另外值得注意的是,在运用EBSS将细胞进行饥饿处理2小时或者3小时之后,miR-148a-3p对于CTSA蛋白的抑制作用明显增强。此外,miR-148a-3p对于CTSA mRNA以及蛋白的抑制作用还具有时间以及浓度依赖性。之后,通过免疫荧光实验,miR-148a-3p对于CTSA的抑制作用得到了进一步的验证。(3)miR-148a-3p能够抑制溶酶体生成以及自噬过程:首先,通过蛋白质谱分析,我们发现miR-148a-3p能够使得大多数溶酶体相关基因的蛋白水平降低。随后,蛋白免疫印记(WB)实验对质谱分析结果进行了证实。之后,运用LC3作为自噬过程的标志物,通过蛋白免疫印记(WB)实验探索了miR-148a-3p对于自噬过程的调控作用。结果显示,miR-148a-3p使得细胞中LC3 I向LC3 II转化的比例会显著降低,标志着自噬水平降低。而在V-ATPase抑制剂Bafilomycin A1的作用下,溶酶体生成水平降低,自噬体降解减少。由此说明,miR-148a-3p对于自噬过程的抑制是通过抑制溶酶体生成过程而发挥作用的。(4)miR-148a-3p不影响TFEB的转录活性:染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果显示,miR-148-3p的过表达对于转录因子TFEB或者RNA聚合酶II在溶酶体相关基因启动子区的聚集并没有较大的影响,即miR-148a-3p并不会影响TFEB的转录活性。(5)miR-148a-3p不会影响转录因子TFEB的表达:首先,我们通过TargetScan数据库预测了miR-148a-3p与TFEB的mRNA之间的序列匹配情况,发现miR-148a-3p的5’端种子序列与TFEB mRNA的3’UTR区存在7个碱基的互补。随后,我们通过荧光素酶报告基因实验发现,过表达的miR-148a-3p对于TFEB mRNA的3’UTR区的荧光素酶活性并没有显著的影响。而数据库预测结果显示,TFEB基因的启动子区与miR-148a-3p之间同样不存在较强的碱基互补。之后的qPCR与蛋白质免疫印记实验(WB)结果显示miR-148a-3p对于TFEB的mRNA以及蛋白水平也不存在显著的影响。综上所述,本研究通过数据库预测、体内外功能以及分子机制的实验探索与反复验证发现,miR-30b-5p能够在细胞核中通过占据转录因子TFEB的结合位点而抑制其转录活性,从而抑制自噬溶酶体相关基因的表达;而miR-148a-3p则能够通过种子序列与溶酶体相关基因CTSA的3’端UTR区相结合,在转录后水平抑制其表达,从而抑制溶酶体的生成及自噬过程。在前者中,miRNA是通过一种全新的作用方式发挥调控作用的,而后者则是miRNA的经典调控作用机制。本研究创新性地发现miRNA可以通过多种作用机制调控自噬溶酶体通路,为阐述miRNAs新的作用机制以及治疗自噬异常相关疾病提供了新思路、新策略。