研究背景随着时代的快速发展人类社会生活水平不断提高,糖尿病的患病率在发展中国家的增长速度快速提高。在肾脏疾病领域,随之而来的是一大人类健康杀手-糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)呈逐年上升的趋势不断增加,现如今全世界范围内约50%的终末期肾衰竭(End-stage renal disease, ESRD)患者来源于DN,是构成ESRD重要的组成部分。较之20世纪,目前越来越多的患者需要肾脏替代治疗来维持生命,为区域经济带来了严重的负担。因此,及早干预、延缓DN的进展显得尤为重要。DN是糖尿病全身微血管并发症中常见且重要的并发症之一。在中国DN是除原发性肾小球肾炎夕ESRD的最主要组成部分,是糖尿病患者死亡的重要病因。然而,目前针对DN的治疗远达不到理想水平,DN的进展仍不能被很好的控制。其主要原因来源于对DN发病机制了解的不够深入,缺乏针对DN发生发展中关键环节的干预措施来指导临床治疗。由此可见,DN发病机制的研究对临床制定干预措施、延缓DN进展具有重要意义。研究表明DN引起的肾损伤主要在肾小球。。肾小球发挥滤过功能的关键在于肾小球滤过膜,肾小球滤过膜主要由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足细胞组成。其中,足细胞在维持肾小球滤过膜功能中的关键作用已被阐明,足细胞病更是归为一类重要的肾脏疾病。大量研究表明,足细胞损伤与DN的发生发展存在因果关系,是DN引起肾损伤的关键环节。晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)是DN进展中一个关键致病因子,在介导DN足细胞损伤中发挥着重要作用。然而,AGEs介导足细胞损伤的具体机制至今尚未明确。近期研究发现肿瘤细胞内晚期糖基化终产物受体(Receptor of advanced glycation end products, RAGE)的活化可通过提高细胞自噬水平抵御化疗药物的疗效。AGEs是RAGE的重要配体,且RAGE在正常机体足细胞中活性水平低,在DN疾病状态下足细胞RAGE活性增强。那么在AGEs介导足细胞损伤的过程中,足细胞自噬水平会出现何种改变?这种改变又将发挥何种作用呢?自噬是生物体依赖溶酶体对自身大分子蛋白以及受损细胞器进行自我降解的生理活动,在维持生物体正常功能以及抵御外界刺激中发挥着重要作用。自噬可分为大自噬、小自噬以及分子伴侣介导的自噬。通常意义上所指的自噬为大自噬,本文所研究的对象也为大自噬(以下简称为自噬)。2010年Hartleben等发现足细胞自噬水平较肾小球其他细胞明显活跃,该发现符合足细胞终末分化期细胞的特殊性。同时Hartleben等阐明：虽然先天性足细胞自噬缺陷的小鼠可发育为正常小鼠,但随年龄的增长足细胞自噬缺陷小鼠对自身稳态的维持明显劣于正常小鼠,且对肾小球疾病的易感性明显大于正常小鼠。可见,足细胞高自噬水平在足细胞正常功能的维持中不可或缺。现目前研究表明自噬的发生为一个动态过程,包含自噬体形成阶段、自噬体与溶媒体融合形成自噬溶酶体阶段及自噬溶酶体降解阶段,并被理解为自噬轴,其过程中任一阶段发生障碍均可阻断自噬轴。因此,更为准确的探讨自噬轴活性的方法不仅是从静态的角度去研究而更需以动态变化的视角去观察。在自噬研究中,最受瞩目的明星分子为微管相关蛋白轻链3 II(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)。LC3Ⅱ由胞浆型LC3I转化而来,位于自噬体膜,是自噬体的重要标记蛋白,现阶段观察LC3 II的动态变化及水平是研究自噬轴的基本方法和策略。在自噬轴的调控中涉及一个重要的信号通路-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1 (Mammalian target of rapamycincomplex 1, mTORC1)信号通路,是自噬轴活性水平调节过程中重要的负调控机制。目前有研究报道,DN疾病状态下肾小球足细胞mTORC1活性显著增强且在DN的疾病发生中发挥有重要作用。那么,如果AGEs可引起足细胞自噬轴活性水平改变,这种变化是否与足细胞mTORC1活性状态相关呢?本研究拟从动态的角度来深入探讨AGEs对足细胞自噬轴活性的影响,探讨可能的分子机制并研究AGEs导致的足细胞损伤与自噬轴活性改变之间的联系。从而为DN未来的治疗策略提供新的线索。研究方法一、糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end products-modified bovine serum albumin, AGE-BSA)的制各及纯化(一) AGE-BSA的制备采用0.2MPBS配置含有40 mg/mL BSA与90 mg/mL葡萄糖溶液,采用0.22um的过滤器过滤除菌后在37℃培养箱中避光孵育90天。对照BSA(co-BSA)不加葡萄糖,余处理同上。(二) AGE-BSA的纯化AGE-BSA与co-BSA孵育结束后置换出0.2 M PBS并去除未结合的剩余葡萄糖。检测新制备AGE-BSA的内毒素和糖基化水平后采用BCA法测定其浓度。二、小鼠足细胞培养、鉴定及处理分组(一)小鼠足细胞培养条件永生化足细胞系(MPC)复苏后用含10%FBS的RPMI-1640 和 20-100U/mL重组小鼠γ干扰素在5%C02,33℃环境下诱导传代增殖。然后转入5%C02,37℃培养箱,在37℃培养箱中用不含重组小鼠γ干扰素的RPMI-1640加5%FBS在包被有I型鼠尾胶原的培养皿中诱导分化。经8-12 d的培养诱导,足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。(二)小鼠足细胞形态学观察及鉴定将33℃培养箱及37℃培养箱中的足细胞在倒置相差显微镜下拍片,并观察比较两者之间的形态学差异；采用足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin染色确定足细胞是否已分化成熟,成熟足细胞表达并延细胞骨架分布。本实验所有足细胞实验均在分化成熟后进行。(三)成熟足细胞的处理分组(1) AGE-BSA足细胞损伤模型的建立(2)足细胞自噬体生成活性动态检测方法构建(3) AGE-BSA对足细胞自噬活性的影响(4) AGE-BSA对足细胞mTORC1活性的影响及其与足细胞受损自噬轴联系。三、检测内容检测足细胞活动性；Podocin、LC3Ⅱ、P62的蛋白水平；mTORC1的活性水平；自噬体数目变化。四、统计学处理计量资料数据以均数±标准差(x±SD)表示,采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。多组间结果比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法。方差齐采用LSD-t法进行组间多重比较,方差不齐采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。如总体比较具有统计学差别,进一步进行两两比较。双侧P<0.05定义为有统计学差异。结果一、AGE-BSA足细胞损伤模型的建立(一) Western blot检测AGE-BSA对足细胞标志蛋白Podocin的表达水平的影响足细胞分化成熟后将足细胞分为对照组、co-BSA组、AGE-BSA组。干预结束后采用Western blot检测podocin的蛋白水平。结果显示AGE-BSA组较对照组Podocin蛋白水平明显降低且有统计学差异,co-BSA组与对照组相比差别不具有统计学差异。(二)划痕实验检测AGE-BSA对足细胞移动性的影响足细胞培养成熟后分别通过划痕实验检测上述分组对足细胞移动性的影响。结果显示AGE-BSA组较对照组发生迁移的足细胞数目明显增多且有统计学差异,co-BSA组与对照组相比差别不具有统计学差异。二、建立足细胞自噬体生成活性动态检测方法(一) Western blot检测不同时间点氯喹处理后足细胞LC3Ⅱ及P62蛋白水平足细胞培养成熟后将足细胞分为氯喹0h组、氯喹2h组、氯喹4h组、氯喹6h组,处理结束后采用Western blot检测白噬体标志蛋白LC3Ⅱ。两组间差异具有统计学意义。氯喹(10μM)干预足细胞后LC3Ⅱ表达水平均明显升高且呈现出显著的时间依赖性。采用同样的方法检测P62的蛋白水平,随着氯喹(10μM)干预时间的延长,P62蛋白水平逐渐升高,也呈现出明显的时间依赖性,两组间存在统计学上差异。(二)激光共聚焦显微镜及电镜观察不同时间点氯喹处理后足细胞自噬体数目改变足细胞分化成熟后采用一定量的mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足细胞,24h后给予氯喹干预0h、2h、4h、6h,细胞固定后应用激光共聚焦显微镜观察不同干预下足细胞自噬体数目(自噬体呈现黄色,自噬溶酶体呈现红色)。氯喹Oh组、氯喹2h组、氯喹4h组、氯喹6h组两组间差异具有统计学意义,随氯喹干预时间的延长自噬体数目不断累积。分化成熟足细胞给予氯喹相应处理后收集各处理组细胞,于电镜下观察各处理组足细胞自噬体数目。电镜结果进一步证实随着氯喹干预时间的延长,足细胞自噬体的数目逐渐增加(电镜只用来定性,因此未行统计分析)。三、AGE-BSA对足细胞自噬活性的影响(一) AGE-BSA对足细胞自噬相关蛋白分子LC3Ⅱ、P62蛋白水平的影响足细胞分化成熟后分为对照组、co-BSA组、AGE-BSA组,干预72h后采用Western blot检测足细胞内LC3Ⅱ的蛋白水平。AGE-BSA组较control组LC3Ⅱ蛋白水平明显降低且有统计学差异, co-BSA组与对照组间不具有统计学差异。同样采用Western blot检测自噬轴活性相关蛋白P62的蛋白水平。AGE-BSA组较对照组P62蛋白水平明显上调且具有统计学差异,co-BSA组与对照组相比差别不具有统计学差异。(二) AGE-BSA对足细胞自噬体数目的影响mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足细胞,按上述处理干预足细胞后观察足细胞自噬体。AGE-BSA组较对照组自噬体数目明显减少,具有统计学差异。co-BSA组与对照组相比差异不具有统计学差异。(三) AGE-BSA抑制足细胞白噬体生成活性将分化成熟足细胞分为对照组、氯喹2h组、氯喹4h组、氯喹6h组、co-BSA组、co-BSA+氯喹2h组、co-BSA+氯喹4h组、co-BSA+氯喹6h组、AGE-BSA组、AGE-BSA+氯喹2h组、AGE-BSA+氯喹4h组、AGE-BSA+氯喹6h组。干预结束后采用Western blot检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ。AGE-BSA氯喹干预系列组较对照氯喹干预系列组LC3Ⅱ蛋白水平具有明显下调趋势,且差异具有统计学意义。co-BSA加入氯喹干预组与对照氯喹干预组LC3Ⅱ蛋白水平无明显差异。四、AGE-BSA对足细胞mTORC1活性的影响及其与足细胞受损自噬轴联系(一) AGE-BSA对mTORC1活性的影响mTORC1活性通过其底物P70S6K的磷酸化水平来检测。本实验中将足细胞分化成熟后分为对照组、co-BSA组、AGE-BSA组,干预72h后采用Western blot检测P70S6K及其磷酸化形式P-P70S6K蛋白水平,比较各组间P-P70S6K蛋白水平。AGE-BSA组较对照组P-P70S6K蛋白水平明显升高且有统计学差异,co-BSA组与对照组间不具有统计学差异。(二)雷帕霉素通过抑制AGE-BSA/mTORC1增强足细胞自噬活性并保护足细胞(1)雷帕霉素通过抑制AGE-BSA/mTORC1增强足细胞自噬活性本实验在AGE-BSA干预的基础上再给予雷帕霉素,AGE-BSA+雷帕霉素组较AGE-BSA组mTORC1活性明显抑制,差异具有统计学意义。同时AGE-BSA+雷帕霉素组较AGE-BSA组LC3Ⅱ蛋白水平明显升高,差异具有统计学意义。(2)雷帕霉素通过抑制AGE-BSA/mTORCl保护足细胞检测LC3Ⅱ的同时,我们检测了足细胞损伤标志物Podocin的变化。AGE-BSA组在给予雷帕霉素处理后较未给予组Podocin蛋白表达水平明显上调,差异具有统计学意义。结论在AGE-BSA体外介导足细胞损伤模型中,mTORC1活化抑制足细胞自噬体生成从而抑制足细胞自噬活性可能是一个引起足细胞损伤的重要机制。这为干预糖尿病肾病足细胞损伤提供了新的思路。