目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种选择性侵犯上、下运动神经元的慢性进行性疾病。临床特征是上、下运动神经元受损的症状并存，而感觉和括约肌功能一般不受影响，其发病机制尚不明确。约5-10%为家族性ALS（familialALS，fALS），90-95%是散发性ALS（sporadicALS, sALS）。fALS和sALS的临床表现很相似，大约20%fALS病例及4%sALS病例与铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxidedismutase1，SOD1）突变有关，其中以G93A位点突变最常见，即在基因密码子第93位点甘氨酸代替丙氨酸。SOD1-G93A转基因小鼠表现为进行性运动神经元变性，与人类ALS相似，是世界上研究ALS的公认动物模型。对ALS的诊断主要是依据典型的临床症状、起病形式、肌电图改变等。1998年重新修订的ALS的El Escorial诊断标准中没有明确的指出要排除感觉系统的受损，但目前临床医生在诊断ALS时有一条重要的依据是没有感觉障碍。上世纪九十年代有报道ALS患者出现感觉障碍[1]。此后又有病例报道描述了ALS患者中出现感觉系统的损伤，表现感觉神经元变性、神经传导速度降低、轴索损伤、深感觉和触觉异常[2-4]。对fALS的经典模型SOD1-G93A转基因小鼠研究发现其有感觉系统的损伤，感觉神经元、感觉神经和脊髓后索均有受累[5]。这些研究结果挑战了目前对该病的普遍认识。本研究在此基础上，应用HE、甲苯胺蓝和银染色法研究了SOD1-G93A转基因小鼠腰髓神经根的形态学变化，应用免疫印迹法研究突变SOD1蛋白、自噬标示物LC3Ⅱ和P62、氧化应激标示物HO-1和GCLC随病程进展的表达变化，探讨其在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓神经根中的变化规律，研究感觉和运动根受累的差异性并初步探讨其损伤机制，为以后ALS的诊断和鉴别诊断提供实验依据。方法：1转基因鼠的繁殖SOD1-G93A转基因鼠均饲养在恒温（25-27℃）、恒湿、无特定病原菌（specific pathogen free, SPF）环境中，以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料、无菌水进行喂养。动物实验过程遵守河北省实验动物管理办法规定。为维持B6SJL-TgN（SOD1-G93A）1Gur转基因小鼠突变基因稳定下传，将B6SJL SOD1-G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖，两种小鼠均购自美国Jackson实验室（Bar Harbor, ME, USA），最初由Gurney等研制。子代鼠尾部组织在三周左右经PCR基因扩增鉴定，确定是否携带有hSOD1基因。2运动功能评分及实验分组2.1运动功能评分运动功能评分从小鼠50天开始每天评分一次。采用4分评分系统。（1）4分无运动障碍，无体重减轻；（2）3分悬尾时后肢震颤；（3）2分步态异常；（4）1分至少一侧后肢拖拽；（5）0分将小鼠仰或侧卧，30秒内不能翻正。2.2实验分组依据SOD1-G93A小鼠的发病规律分为症状前期（60天）、症状早期（100-120天）和终末期（130-150天）3个时间点取材。模型组为SOD1-G93A转基因小鼠，对照组为成年非转基因同窝对照小鼠，每组每个时间点6只小鼠。症状前期组取自出生后60天，体重无减轻且无临床症状，评分4分。症状早期指体重开始减轻、出现步态异常，评分2分。终末期指小鼠体重减轻20%以上，仰卧30秒不能翻身，评分0分。3实验方法3.1取材各个时期小鼠用10%的水合氯醛腹膜内注射麻醉后，分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓神经根组织迅速投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。3.2HE染色法腰髓神经根经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋；切成5μm切片；脱蜡，脱水；苏木精液染色5分钟；流水稍洗去苏木精液1-3秒；1%盐酸乙醇1-3秒；蒸馏水过洗1-2秒；0.5%伊红液染色1-3分钟；蒸馏水稍洗1-2秒；脱水；透明；封片。3.3甲苯胺蓝染色腰髓神经根经4%多聚甲醛固定后置入1%四氧化锇溶液中孵育1小时；丙酮脱水；环氧树脂812包埋；切成1μm切片；1%甲苯胺蓝溶液染色10分钟；蒸馏水冲洗，烘干。3.4轴索银染色法腰髓神经根经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，切成12μm切片；脱蜡，脱水；置于0.14%硝酸银溶液中，56-60℃孵育24小时；2%硫酸钠和1%对苯二酚处理6分钟；蒸馏水冲洗15分钟后置入1%氯化金溶液中调色；蒸馏水冲洗后置入新鲜配制的2%草酸中10分钟；蒸馏水冲洗后置入5%硫代硫酸钠中孵育3分钟；蒸馏水冲洗，置入0.1%Luxol快蓝溶液中56-60℃过夜；95%乙醇洗去多余染液；交替置于70%乙醇和0.5%硫酸锂溶液中至单个神经纤维显示出来；脱水，封片。3.5免疫印迹（Western blotting）分别取神经根组织提取总蛋白，BCA法测取蛋白浓度。每个样品按40μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜，室温脱脂奶粉（PBS稀释）封闭1小时后，分别加羊抗SOD1抗体（1:500）、兔抗ACTIN抗体（1:200）、兔抗P62抗体（1:1500）、兔抗LC3Ⅱ（1:1500）、兔抗GCLC（1:500）或兔抗HO-1（1:500）4℃摇床过夜。次日，TPBS洗膜3次，每次5分钟。然后分别加入抗兔和抗羊荧光二抗（1:5000）室温孵育1小时，TPBS洗膜2次，PBS洗膜1次，每次均为5分钟，Odyssey红外扫描成像系统（美国LI-COR公司）扫膜并分析结果。计算目的条带与ACTIN的灰度比值并进行统计学处理。3.6统计学分析实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS13.0.4软件，统计方法为多样本参数方差分析。P<0.05有统计学意义。结果：1转基因鼠的鉴定子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示：位于300-400bp之间的条带（324bp），为内参照IL-2的PCR产物；位于200-300bp之间的条带（236bp），为人SOD1基因的PCR产物。2临床表现在60天及以前，SOD1-G93A小鼠无明显临床变化，评分4分。80-90天左右，悬尾实验时小鼠开始出现双后肢震颤，评分3分。在100-120天左右SOD1-G93A小鼠逐渐出现一侧或双侧后肢明显无力、肌肉萎缩及步态异常，评分2分。之后，双后肢进行性肌肉萎缩，不能支撑身体，进而至少一侧后肢完全瘫痪，行走时拖拽，评分1分。约在130-150天左右，将其仰卧后30秒内小鼠不能自行翻转，体重下降超过20%，达到终末期，评分0分。而同窝对照组小鼠无上述表现，评分始终为4分。3腰髓前后根形态学变化通过HE染色观察到终末期转基因小鼠腰髓神经根纵切面神经纤维排列紊乱、细胞成分增多；银染色法观察终末期转基因小鼠腰髓神经根轴索纵切面，发现轴索变性、肿胀、崩解及走行不连续。甲苯胺蓝染色法观察转基因小鼠腰髓神经根横断面，发现神经纤维轴索变性或消失，髓鞘崩解、排列紊乱，有髓神经纤维数量明显减少。腰髓腹侧根和背侧根的改变相似，对照组小鼠没有类似改变。4目的蛋白的表达4.1通过免疫印记法观察G93A转基因小鼠腰髓神经根中突变SOD1蛋白表达量，发现，症状前期突变SOD1蛋白表达即有所增多，症状早期明显升高，终末期达高峰（P<0.05）。在不同的时期，腹侧根中突变SOD1蛋白含量均高于背侧根（P<0.05）。4.2通过免疫印记法观察G93A转基因小鼠腰髓神经根中自噬标示物LC3Ⅱ和P62的表达，发现LC3Ⅱ蛋白含量在症状前期少量增加，随着病程进展而增多，终末期达高峰，而且LC3Ⅱ在腰髓腹侧根中的含量在每个时期均多于背侧根（P<0.05）。腰髓腹侧根中P62蛋白的含量在症状前期开始增多，随着病程进展不断增多，至终末期含量达高峰（P<0.05），而背侧根中的P62蛋白含量在症状期前无增多，在症状早期少量增多，至终末期显著增多（P<0.05）。4.3通过免疫印记法观察G93A转基因小鼠腰髓神经根中氧化应激标示物HO-1和GCLC表达，发现两者有同样的变化趋势，即在症状前期少量增加，随着病程进展而增多，终末期表达最高。而且两者在腰髓腹侧根中的含量在每个时期均多于背侧根（P<0.05）。结论：SOD1-G93A转基因小鼠腰髓腹侧根和背侧根中均存在明显的神经纤维变性，前者重于后者。神经根中突变SOD1蛋白随着病程进展而增多，腹侧根中的突变SOD1蛋白含量在不同的时期均比背侧根中多，自噬标示物LC3Ⅱ和氧化应激标记物GCLC、HO-1也存在同样的变化趋势。腰髓腹侧根中自噬底物P62随着病程进展不断增多，至终末期达高峰，而其在背侧根的含量至终末期才有显著增多。我们认为SOD1-G93A转基因小鼠腰髓存在感觉根的损伤，其程度轻于运动根，其机制与突变SOD1蛋白聚集、氧化应激及自噬功能改变有关。