阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和大肠杆菌(Escherichia coli)属革兰氏阴性菌,是畜禽消化道中最常见的致病菌,在其生长过程中产生的胞外物质可形成生物膜。畜禽宰杀加工过程中以及蛋品、奶液中残留的这类致病菌附着的物体表面均易发现生物膜,而被生物膜包裹的微生物对抗生素、抑菌剂存在抗性,不易将其彻底灭活。生物膜作为一种覆盖于物体表面的含有微生物集落的黏性膜层,对腐败菌的生长繁殖及存活具有重要意义,不利于食物的保存及保鲜。苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)、乳酸(lactic acid,HL)、柠檬酸(Citric acid,CA)为三种天然有机酸,其中PLA具有广谱抑菌性,HL和CA对致病菌也有一定的抑制作用常被用作食品添加剂。现今有机酸对生物膜的作用鲜有报道,本文以从新鲜羊胴体表面分离出阴沟肠杆菌CY4(Enterobacter cloacae CY4,E.cloacae CY4)和大肠杆菌K12(Escherichia coli K12,E.coli K12)为目标菌株,研究三种有机酸对菌株生物膜的抑制作用,并对其分子水平的抑制机理进行初步探究。本实验通过传统分离方法确定羊肉加工过程中的主要菌群组成,筛选出成膜能力较强的优势菌株进行生物膜的抑制实验。通过最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)测定、泳动能力、结晶紫染色、激光共聚焦显微镜(scanning laser confocal microscope,CLSM)和扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)等观察有机酸的处理对生物膜形成的抑制作用,而后经蛋白组结果得出显著表达的蛋白再利用相关基因敲除株进行转录组分析,最终分析得出有机酸的处理对生物膜形成可能的抑制机理。本实验表明:PLA、HL、CA对E.cloacae CY4和E.coli K12的MIC都为5 mg/m L。但对相同浓度下的同一种有机酸来说,E.coli K12的耐受力比E.cloacae CY4要弱,且相同浓度的有机酸中PLA的作用较其它两种酸更为明显。1/2 MIC和1/4 MIC有机酸对菌株的泳动能力有明显的抑制作用;1/2 MIC和1/4MIC有机酸普遍抑制了生物膜的形成,但在48 h时这种抑制作用会有所下降;有机酸的处理降低了多糖含量,使菌株生物膜的厚度大大降低、表面孔洞增多,菌体结构松散、菌株表面附着物大幅减少;荧光定量PCR结果进一步证实了有机酸降低了菌体内与黏附和多糖产生相关基因的转录水平。通过蛋白组分析发现,E.cloacae CY4生物膜在PLA存在时,菌体内的蛋白表达发生了变化,其中21个蛋白的表达量显著上调,58个蛋白的表达显著下调,差异表达的蛋白主要与氨基酸、碳水化合物、脂质、能量、酶类和信号转导等代谢途径有关,也包含了影响菌体耐酸、生长和蛋白分泌、转运代谢及膜的生长等的转运和调控蛋白。通过蛋白组数据发现E.cloacae CY4生物膜内的菌体细胞在PLA存在的情况下,会应激产生一个与菌体酸耐受相关的Mar R调控蛋白。为了进一步研究转录调控蛋白Mar R如何影响E.cloacae CY4细胞在有机酸下的生长和生物膜的形成,首先分析了E.coli K12Δmar R突变菌与野生菌在生物膜形成时的变化,发现敲除菌K12Δmar R在泳动能力和成膜能力等方面都有明显下降,并且K12Δmar R突变菌在PLA存在时更不容易形成生物膜。通过转录组分析转录蛋白Mar R相关的上下游蛋白,发现mar R基因敲除后,K12Δmar R共有40个基因上调,133个基因下调,其中,上调的基因与泛酸、Co A生物合成,果糖代谢,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸的代谢等有关,下调的基因与Mar A蛋白、群体感应系统、β-内酰胺抗性、双组分系统、各种生物合成和代谢过程的表达有关。此外,mar R敲除后菌体的酸耐受能力显著下降。通过以上研究证明,PLA、HL和CA对E.cloacae CY4和E.coli K12的生物膜形成有明显抑制作用。荧光定量、蛋白组和转录组也表明,有机酸处理会抑制生物膜菌体细胞内与运动能力、胞外物质的合成和分泌、碳水化合物和氨基酸代谢、能量代谢等相关基因的表达,同时还诱导了酸胁迫应激调控基因mar R的表达,对菌株形成保护机制。