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胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)是一种由BSH基因编码的胞内酶,主要由乳酸菌产生,是微生物在生长和繁殖过程中所产生的代谢产物。BSH酶能够水解甘氨酸胆盐和结合态牛磺酸胆盐,将二者转变成游离胆酸和氨基酸。去结合型胆盐的重吸收效率比结合型胆盐低,这样致使大量的去结合型胆盐从粪便中排出,机体则需要消耗更多的胆固醇重新合成胆酸盐来弥补去结合胆盐的大量流失,从而降低血清胆固醇含量。本文为探讨BSH基因在原核、真核表达系统中的表达行为,分别构建BSH基因的原核和酵母表达载体,并在大肠杆菌和酵母表达系统中进行表达,为BSH基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。根据pET-30a(+)载体序列多克隆位点,参照GenBank报道的胆盐水解酶(BSH)基因序列(EU477374) ,利用Primer 5软件设计了一对扩增BSH基因序列的特异性引物。提取植物乳杆菌基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增BSH基因,与pMD18-T载体连接,转化E.coli DH5α′,蓝白斑筛选构建的pMD18-BSH质粒,经PCR、酶切、测序鉴定后,以BamH I和Sal I双酶切pMD18-BSH和表达载体pET- 30a(+),T4连接酶连接,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3) ,筛选构建pET30a(+)-BSH质粒,IPTG诱导表达,电洗脱法纯化表达蛋白,进行SDS-PAGE电泳并经Western bloting鉴定BSH融合蛋白的抗原性;参考pGAPZαA载体序列多克隆位点,根据BSH基因序列设计引物,以pMD18-BSH质粒为模板,PCR扩增目的BSH基因。PCR产物与pGAPZαA酵母表达载体经EcoR I、Xho I双酶切,T4连接酶连接,转化E.coli DH5α′,筛选重组子。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化,电转化至P. pastoris SMD1168中,高浓度的ZeocinTM抗性筛选高拷贝转化子,用BSH基因特异引物进行PCR鉴定,SDS-PAGE分析并经Western bloting鉴定BSH融合蛋白的免疫学活性。本研究克隆了植物乳杆菌中的胆盐水解酶(BSH)基因,成功构建了pET30a(+)-BSH重组质粒,获得了稳定表达pET30a(+)-BSH的大肠杆菌原核表达体系,在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导3h表达水平最高,表达出的41kDa蛋白(含6个组氨酸标签),初步纯化后,纯度达92%以上。Western bloting分析结果表明该蛋白可与植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应,具有较好的抗原性;此外,以pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建了高效、分泌型的BSH毕赤酵母表达系统。经SDS-PAGE检测,在相对分子质量约35kDa左右处可见目的蛋白表达条带。Western bloting鉴定结果显示,表达蛋白具有良好的免疫学活性,这为进行BSH的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。