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仔猪先天性震颤(Congenital Tremors,CT),又称为传染性先天性震颤、“仔猪抖抖病”,是新生仔猪出现全身或局部肌肉阵发性挛缩为特征的一种传染性疾病。临床上有的整窝发病,有的部分发病,甚至症状可延续到保育猪和育肥前期猪,严重影响猪的生长和成活率,给养猪业造成较大的经济损失。仔猪先天性震颤瘟病毒(Atypical Porcine Pestivirus,APPV),是一种新发现的,可引起CT的瘟病毒属成员。但到目前为止,未见APPV分离成功的报道,其生物学特性,快速检测和防控等仍是研究的重点。本试验对APPV快速检测方法,基因组序列,分离和主要免疫原基因的蛋白表达等进行研究,以期为APPV及CT进一步研究和防控奠定基础。1、APPV RT-PCR检测方法的建立及应用以GenBank中APPV全基因组序列作为参考序列,设计一对引物;以临床疑似CT的病死猪病料为样本,提取RNA作模板,通过优化条件和序列测定,建立检测APPV的RT-PCR方法。结果表明,从CT病死猪的淋巴结中扩增到与预期片段大小一致的片段,经序列测定和比对分析,扩增片段核苷酸序列与GenBank中的APPV相应片段的核苷酸序列相似性在89%以上;建立的RT-PCR方法只能扩增出APPV片段,而其它几种猪常见病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,且可检测的最低cDNA浓度为184.11 ng/μL;对临床送检的病料进行检测,疑似CT病例的检出率达100%。结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床疑似APPV引起CT的快速检测,以及病毒鉴定和分子流行病学调查。2、1株APPV全基因组的序列测定、分析与第2株部分APPV序列分析以APPV阳性病料为待检样品,根据GenBank中的APPV全基因组序列,设计7对引物,进行RT-PCR,序列测定和拼接,并利用MEGA7.0软件和DNAStar软件绘制进化树并进行相似性分析。结果显示,其中1份病料扩增到7个基因片段,经拼接,获得1株APPV全基因组序列,命名为JX-JM01-2018A01(GenBank登录号:MG792803.1),另1份病料仅扩增拼接出约8000 nt的片段,命名为JX-02,包含完整的主要免疫原E0和E2的基因、瘟病毒属病毒非保守的NS2-3基因序列。JX-JM01-2018A01全基因组长11.5 kb,与GenBank中的APPV位于同一进化分支,而BVDV及BDV等其它动物瘟病毒在另一进化分支;与GenBank中的APPV参考全基因组序列似性在82.5%~93.2%之间;JX-JM01-2018A01和JX-02的E0、E2和NS2-3的核苷酸序列与GenBank收录的APPV相应序列相似性分别为:82.5%~93.2%,82.3%~93.1%,80.3%~92.9%;推测氨基酸序列同源性分别为:38.4%~51.6%,33.0%~37.2%,36.0%~39.0%。E0、E2、NS2-3的进化树分析表明,JX-JM01-2018A01和JX-02位于同一进化分支,进化距离近,与BVDV、BDV等其它动物瘟病毒位于不同的进化分支。3、APPV的初步分离和鉴定取检测为强阳性的病料,经处理后分别接种于PK-15细胞、IBRS-2细胞,制备APPV阳性新生仔猪脑原代细胞、接种处理的病料悬液。结果,接毒的PK-15细胞盲传20代,仅F1和F6细胞液可检测到与目的片段大小一致的核苷酸片段,序列测序结果也表明片段是APPV,其它代次均为阴性;IBRS-2细胞接毒后盲传10代,经检测均为阴性;APPV阳性新生仔猪的脑原代细胞体外培养7天,检测APPV为阴性,接毒后培养、传代3次,经检测APPV均为阴性。4、APPV免疫保护原基因E0、E2蛋白的原核表达根据JX-JM01-2018A01全基因组序列,设计引物,扩增完整的主要保护性抗原基因E0、E2,构建重组原核表达载体pET-E0、pET-E2、pGEX-E0、pGEX-E2,经优化诱导表达条件,结果均不能表达出目的蛋白产物。将E0、E2基因序列进行密码子优化,再构建重组表达载体pET-E0y、pET-E2y、pGEX-E0y,经优化诱导条件,SDS-PAGE检测,均可表达出目的大小一致的蛋白;以重组蛋白GST-E0y进行小白鼠免疫,以重组蛋白HIS-E0y为检测抗原,经检测,免疫小白鼠均能产生高水平的抗体。