【摘 要】
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本文从柽柳(Tamarix hispida) cDNA文库中克隆到了一个Prx基因(ThPrx1),该基因是活性氧清除酶类过氧还蛋白(Prx)家族成员。ThPrx1全长为851 bp,开放读码框自165位的ATG起,止
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本文从柽柳(Tamarix hispida) cDNA文库中克隆到了一个Prx基因(ThPrx1),该基因是活性氧清除酶类过氧还蛋白(Prx)家族成员。ThPrx1全长为851 bp,开放读码框自165位的ATG起,止于653位的TAA,全长489 bp,共编码162个氨基酸,该蛋白的分子量为17.5KD,理论等电点为6.08。采用Tail-PCP方法扩增出ThPrx1基因的启动子,该启动子的长度为1768 bp。将ThPrx1基因克隆到酵母表达载体pYES2中,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),并用转空pYES2载体的酵母作为对照。分别用NaCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高温、低温、山梨醇、甲基紫精胁迫条件处理转ThPrx1基因酵母与对照(转化空pYES2载体的酵母),试验结果表明：ThPrxl基因对NaCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高温、低温、山梨醇、甲基紫精等胁迫均具有抗性能力。利用SMART技术,构建了以酵母菌株Y187为宿主、用于酵母双杂交柽柳cDNA文库。所获得的文库的插入长度在750 bp到3500 bp之间。转化效率为1.89×107cfu/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.13×107pfu/ml,重组率为80%。将ThPrx1基因构建到酵母双杂交载体(pGBKT7 DNA-BD)中,经毒性和转录自激活检测表明,ThPrxl蛋白无自转录激活能力,其表达蛋白对酵母无毒性,可以用于双杂交分析。用pGBKT7-ThPrx1作为诱饵,筛选了柽柳酵母双杂cDNA文库。用醋酸锂转化法将诱饵和文库质粒转入酵母菌株Y2H,经TDO/X-a-Ga/AbA(Aureobasidin A)培养基筛选得到阳性克隆通过进一步的双杂交筛选验证获得了两个与ThPrx1蛋白互作的蛋白,分别是油体钙蛋白(calcium lipid binding protein)和与CONSTANS互作蛋白(CONSTANS interacting protein)。
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