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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其侵袭转移与术后复发是患者死亡的主要原因之一。因此,探索肝癌侵袭转移与复发的分子机制,寻求有效的应对措施,对改善肝癌患者的预后具有十分重要的意义。HIF-1信号通路在肿瘤发生发展中的作用已受到广泛地关注,其中主要集中在HIF-1α的肿瘤生物学功能上,而对ARNT(HIF-1β)的生物学功能知之甚少。本研究首先观察ARNT在肝癌和癌旁组织中的表达与肝癌患者术后预后的关系;然后探讨ARNT表达改变对实验性肝癌生长和侵袭转移的影响;最后进一步明确ARNT影响肝癌生长与侵袭转移的可能分子机制。第一部分芳香烃受体核易位蛋白ARNT在肝癌组织中的表达及其意义目的:比较ARNT在肝癌及相应癌旁组织中的表达差异,分析ARNT在原发性肝癌中的表达与原发性肝癌临床病理特征及其预后的关系。方法:应用组织微阵列技术和免疫组织化学染色方法,回顾性研究105例行手术切除并经病理学证实的肝细胞癌标本(癌和癌旁组织)中ARNT的表达情况,Log-rank法比较肝癌中不同ARNT表达组间生存率和复发率的差别,COX回归模型进行单因素、多因素分析各有关因素对患者生存率和复发率的影响。结果:免疫组化染色显示ARNT为核内表达蛋白,在肝癌和癌旁组织中的阳性率分别为53.3%和71.4%,两者间差异明显(p=0.007)。ARNT表达与肿瘤大小相关(p=0.009),而与年龄、性别、AFP、播散灶、TNM分期、癌栓和肝硬化背景等临床病理因素无关(p值均＞0.05)。肿瘤ARNT表达与肝癌患者的生存和复发显著相关,其中ARNT低表达组患者的中位生存时间(26.3months)明显短于ARNT高表达组患者的中位生存时间(84.0months),p=0.000;ARNT低表达组患者的术后5年复发率(46.9%)明显高于ARNT高表达组患者(32.1%),p=0.016。COX回归模型单因素分析发现肿瘤大小、播散灶、TNM分期、癌栓、AFP、肝硬化背景和癌内ARNT表达是影响肝癌患者总体生存的相关因素,而且肿瘤大小、播散灶、TNM分期、癌栓、癌内ARNT表达与肿瘤复发相关;多因素分析则发现肿瘤TNM分期是影响肝癌患者生存的独立预后因素,而癌内ARNT表达是影响肝癌患者预后的独立保护因素。结论:ARNT在肝癌发生中可能有重要作用;癌内ARNT低表达是原发性肝癌不良预后的独立影响因素。第二部分ARNT表达改变对实验性肝癌生长与侵袭转移的影响目的:明确ARNT表达与实验性肝癌生长和侵袭转移的关系。方法:构建靶向Arnt的重组慢病毒载体pLentiARNTi-1和pLentiARNTi-2,转染HCCLM6细胞,筛选出GFP稳定表达的细胞株,经RT-PCR和Western Blotting验证ARNT表达改变后,分别用细胞荧光定量法、FACS、Transwell侵袭试验和细胞划痕试验检测细胞增殖能力、周期时相、侵袭能力以及运动能力的变化。将细胞接种于裸鼠体内,研究ARNT表达改变后,肝癌体内生长与肺转移、腹腔转移能力的改变。结果:靶向Arnt的重组慢病毒载体pLentiARNTi-1和pLentiARNTi-2转染HCCLM6细胞,筛选出两株ARNT表达改变明显的稳定细胞株LentiARNTi-1和LentiARNTi-2;细胞荧光定量法检测结果显示ARNT表达越低,细胞增殖越快;FACS检测结果显示ARNT表达越低,S-phase占的比例越大;Transwell侵袭和细胞划痕试验结果表明ARNT低表达组细胞的侵袭和运动能力明显增强;体内实验结果显示ARNT低表达组肿瘤生长加快,肺转移灶和腹腔转移灶明显增加。结论:ARNT与肝癌的生长及侵袭转移负相关,具有抑制肝癌生长和侵袭转移的作用。第三部分芳香烃受体核易蛋白ARNT抑制肝癌生长与侵袭转移的机制研究目的:探讨ARNT抑制肝癌生长与侵袭转移的分子机制。方法:在HCCLM6细胞中,用Realtime PCR和Western Blotting检测ARNT表达下调后与细胞增殖、侵袭转移相关的靶基因或靶蛋白的表达变化;用IHC染色验证以上指标在裸鼠原位移植瘤中的表达改变。结果:Realtime PCR和Western Blotting检测结果表明,在下调ARNT表达的HCCLM6细胞中,增殖相关指标cyclinE和CDK2表达水平升高;侵袭转移相关指标MMP7表达水平升高,TIMP-1、TIMP-2表达水平下降。IHC染色结果证实以上指标在体内的变化。结论:ARNT可通过下调cyclinE和CDK2、上调TIMP-1和TIMP-2、下调MMP7的表达来抑制肝癌的生长和侵袭转移。