AbFtsZ2-1在金边红苞凤梨叶片白化失绿突变中的功能分析

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金边红苞凤梨因其具有绿白分明的金边嵌合叶片,已成为盆栽和切花市场热门的新型观赏植物。红苞凤梨金边嵌合叶片由绿色正常细胞和白化失绿突变细胞组成,深入研究其叶色白化突变的形成机理,对揭示叶色嵌合体形成机理、培育叶色嵌合新品种具有重大意义。本研究以金边红苞凤梨嵌合叶片的绿色和白色组织为材料,分析了绿白组织间生理生化与组织结构间的差异,结合基因表达分析及亚细胞定位分析,筛选确定AbFtsZ2-1基因为叶片白化失绿突变的关键基因,对AbFtsZ2-1进行了克隆及功能鉴定,探讨了其在金边红苞凤梨叶片白化失绿突变中的作用。研究结果如下:1金边红苞凤梨叶片绿白组织之间叶绿素含量差异极显著,绿色组织含量为白色组织的34倍。利用徒手切片观察到具有叶绿体的绿色细胞主要集中分布在叶片中央的绿色组织中,而叶片边缘的白色组织中基本未见含叶绿素的绿色细胞。透射电子显微镜超薄切片观察表明叶片中央绿色组织的叶肉细胞中叶绿体数量显著多于白化细胞中叶绿体数量,其叶绿体形状饱满,结构完整,而白色组织细胞中叶绿体缺失或数量极少,体积较小,且形态异常,发育不良。酶活性测定则显示白色组织中GTPase活性显著上调。前期嵌合植株转录组及蛋白组测序分析表明白色组织中AbFtsZ2-1基因转录水平和蛋白水平都显著高于绿色组织,初步推测AbFtsZ2-1基因可能参与金边红苞凤梨叶片金边组织细胞的失绿白化突变。2实时荧光定量(q RT-PCR)分析表明,金边红苞凤梨叶片白色组织中AbFtsZ2-1基因表达量显著高于绿色组织,与前期转录组及蛋白组测序结果一致。瞬时转化烟草的亚细胞定位表明AbFtsZ2-1蛋白定位在叶绿体中,说明AbFtsZ2-1可能是抑制叶绿体分裂,导致细胞叶绿体缺失或减少,最终造成白化突变的关键基因。3根据前期转录组测序数据设计特异引物,在金边红苞凤梨c DNA中成功克隆到全长为2032bp的AbFtsZ2-1基因序列,包含一个长度为1434bp的开放阅读窗(ORF),编码477个氨基酸。AbFtsZ2-1具有FtsZ家族典型的GTP结合结构域和C端GTPase激活结构域,另有一个属于FtsZ2亚家族的C端肽,与菠萝AbFtsZ2-1同源性最高,与其他物种同源蛋白同源性在72%以上。4构建p TCK303-AbFtsZ2-1-RNAi干扰载体并以农杆菌介导转化烟草,用含潮霉素(Hyg)的培养基筛选后获得转基因植株。实时荧光定量(q RT-PCR)检测转基因株系中FtsZ2-1基因的表达量均显著低于野生型烟草,同时转基因植株的GTPase活性也显著下调。表型观察转基因烟草叶色黄化,叶片长势较弱,叶片中叶绿素a、叶绿素b含量均显著下调。转基因烟草叶片中叶绿体数量减少,且体积较小,形态较圆。说明FtsZ2-1基因表达受抑,导致叶绿体分裂受阻,叶绿体结构发育不完整,从而致使叶绿素的合成整体下调,最终造成植株叶片黄化。
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