论文部分内容阅读
肾脏纤维化是几乎所有慢性和进行性肾病终末阶段的共同病理表现,其特征为损伤、炎症、肌成纤维细胞活化和迁移以及细胞外基质沉积和重塑。JNK相关的亮氨酸拉链蛋白（JNK-associated leucine zipper protein,JLP）是JNK相互作用蛋白（JNK-interacting protein,JIP）家族成员,广泛存在于多种细胞中,为信号传导模块中的多种蛋白分子、转录因子等提供附着平台,在多种信号传导通路及生物学事件中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,JLP敲除的单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）模型小鼠的肾脏纤维化程度较野生型小鼠显著加重,提示JLP在拮抗肾纤维化中起重要作用。本研究构建了肾脏特异性高表达JLP转基因小鼠,观察了支架蛋白JLP高表达对UUO小鼠肾间质纤维化的影响,并研究了支架蛋白JLP高表达对UUO小鼠肾脏自噬及上皮-间充质转分化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）的影响,以期进一步探讨支架蛋白JLP在梗阻性肾病肾脏纤维化形成中的保护作用及可能机制。第一部分肾脏特异性高表达支架蛋白JLP转基因小鼠的构建目的:构建肾脏特异性高表达支架蛋白JLP的转基因小鼠模型。方法:委托赛业（广州）生物科技有限公司构建CMV-loxp-stop-loxp系统高表达m Spag9（JLP）转基因小鼠及肾脏特异性KSP-Cre ERT2小鼠。KSP-Cre ERT2阳性小鼠与m Tm G小鼠杂交,PCR法筛选出子代双阳性小鼠,待其长至4-6周龄时予以他莫昔芬诱导,以m Tm G小鼠为对照,取各组小鼠肾脏做冰冻切片,于荧光显微镜下观察。将loxp-stop-loxp-m Spag9小鼠与KSP-Cre ERT2小鼠杂交,采用PCR法鉴定基因型,获取基因型为loxp-stop-loxp-m Spag9+/KSP-Cre ERT2+(Cre+JLPTG)小鼠,待其长至4-6周龄时予以他莫昔芬。选择同窝C57BL/6N野生型小鼠作为对照,并通过Western Blot及组织免疫荧光检测小鼠各脏器中JLP的表达量,进一步验证肾脏特异性高表达m Spag9转基因小鼠的准确性及特异性。结果:冰冻切片显示,给予他莫西芬的KSP-Cre ERT2+/m Tm G+小鼠肾脏中存在大量GFP阳性的肾小管上皮细胞,肾小球及其他细胞表达td Tomato红色荧光信号,而m Tm G小鼠肾脏中没有GFP信号表达。Western Blot及组织免疫荧光结果显示:经他莫昔芬诱导的Cre+JLPTG小鼠肾脏中JLP表达量显著高于同窝野生型小鼠,而心脏、脾、肺、睾丸等组织中的JLP表达量无明显差异。结论:KSP-Cre ERT2+小鼠的Cre重组酶靶向效率高,并具有细胞特异性。成功构建肾脏特异性高表达支架蛋白JLP的转基因小鼠。第二部分支架蛋白JLP高表达对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化的影响目的:观察在UUO模型小鼠中支架蛋白JLP高表达对肾间质纤维化的影响,探讨在UUO所致的肾间质纤维化形成中JLP的作用。方法:按基因型及处理方式将小鼠分为4组:Cre-JLPTG小鼠假手术组(Cre-JLPTG-Sham)、Cre+JLPTG小鼠假手术组(Cre+JLPTG-Sham)、Cre-JLPTG小鼠手术组(Cre-JLPTG-UUO)和Cre+JLPTG小鼠手术组(Cre+JLPTG-UUO),UUO手术后7d取小鼠肾脏。HE染色及Masson染色观察肾间质纤维化;免疫组化检测肾组织中转化生长因子β（TGFβ）的表达;免疫荧光检测肾组织中ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）、Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）、纤连蛋白（FN）的表达;Western Blot及q PCR检测肾组织ɑ-SMA、COL-Ⅰ、FN和TGFβ蛋白及m RNA的表达水平。结果:Cre+JLPTG组小鼠肾组织中的JLP表达量显著高于Cre-JLPTG小鼠,且随着UUO手术后时间的延长,两种基因型小鼠肾脏中JLP的表达量均逐渐下降。HE染色及Masson染色显示,Cre+JLPTG-UUO组小鼠肾间质的炎性细胞浸润及蓝色纤维沉积较Cre-JLPTG-UUO组明显减少,纤维化程度显著减轻（均P＜0.05）;免疫组化显示,Cre+JLPTG-UUO组肾组织TGFβ的表达较Cre-JLPTG组明显降低（均P＜0.05）;免疫荧光显示,与Cre-JLPTG-UUO组比较,Cre+JLPTG-UUO组肾组织中ɑ-SMA、COL-Ⅰ和FN的蛋白表达量均明显降低（均P＜0.05）;Western Blot显示,Cre+JLPTG-UUO组肾皮质ɑ-SMA、COL-Ⅰ、FN及TGFβ的表达水平显著降低（均P＜0.05）。结论:高表达的支架蛋白JLP可抑制肾间质中的炎症反应及细胞外基质沉积,有效缓解肾脏纤维化。第三部分支架蛋白JLP高表达对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏自噬和EMT的影响目的:观察在UUO模型小鼠中支架蛋白JLP高表达对肾小管上皮细胞自噬及间充质转分化的影响,探讨在UUO所致的肾间质纤维化形成中JLP的可能作用机制。方法:按基因型及处理方式将小鼠分为4组:Cre-JLPTG小鼠假手术组（Cre-JLPTG-Sham）、Cre+JLPTG小鼠假手术组（Cre+JLPTG-Sham）、Cre-JLPTG小鼠手术组（Cre-JLPTG-UUO）和Cre+JLPTG小鼠手术组（Cre+JLPTG-UUO）,UUO手术后7d取小鼠肾脏。Western Blot检测LC3、SQSTM1和Beclin1蛋白的表达;电镜下观察肾小管上皮细胞中的自噬现象。Western Blot检测N-钙黏蛋白（N-cadherin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达情况。结果:Western Blot显示,与Cre-JLPTG-UUO组比较,Cre+JLPTG-UUO组肾组织中LC3和Beclin1蛋白的表达水平明显下降,SQSTM1蛋白的表达水平显著升高（均P＜0.05）;电镜显示,Cre+JLPTG-UUO组小鼠肾小管上皮细胞中的自噬小体较Cre-JLPTG-UUO组明显减少。Western Blot显示,与Cre-JLPTG-UUO组比较,Cre+JLPTG-UUO组小鼠的vimentin蛋白的表达显著下降,E-cadherin蛋白的表达明显增多（均P＜0.05）,而N-cadherin无明显变化。结论:高表达的支架蛋白JLP可抑制肾小管上皮细胞自噬及间充质转分化,在拮抗肾脏纤维化的形成中起到重要作用。