背景及目的:青藏高原,平均海拔4000米以上,号称“世界屋脊”。但是由于空气稀薄、大气压低、紫外线强等因素导致大部分高原地区自然环境十分恶劣。而急性暴露于高原低压低氧环境下,存在着的发生高原疾病风险。人体在高原急性低氧等环境因素影响下会发生一系列的生理病理改变,其中急性低氧环境是导致这些改变的最主要因素。脑是机体最主要的耗氧器官之一,在急性缺氧状态下对缺氧损害具有很高的敏感性,尤其是脑海马结构和功能的损伤最明显。因此如何通过药物预防这种病理性损伤是高原医学脑科学的研究热点。沉默调节蛋白1(Silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)为依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶。SIRT1通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助因1α(peroxisome proliferators activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)等相关因子在细胞线粒体生物合成、细胞的凋亡、组织细胞抗氧化以及在延长细胞寿命方面都起到了非常重要的调控作用。西红花苷是传统药材藏红花(Saffron,Crocus sativus L)的有效活性成分。现代医学研究发现西红花苷具有抗氧化、抗凋亡、抗癌、神经保护及防治心血管疾病等广泛的药理作用。基于课题组前期研究发现西红花苷可以上调高海拔急性低氧条件下大鼠脑海马SIRT1表达。所以针对性提出假设:在急性高海拔低氧条件下西红花苷预处理能否对海马神经元发挥保护作用,以及与SIRT1/PGC-1α通路调节有何联系?为回答以上问题,课题进行了四方面的研究(1)在海拔4200m现场建立大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型;(2)通过西红花苷不同剂量(25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d)预处理对大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型低氧72小时的作用,明确保护作用及SIRT1/PGC-1α通路分子保护机制和西红花苷最佳有效浓度;(3)验证西红花苷最佳浓度预处理对大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型在高海拔急性低氧1、3、5、7天的保护作用及SIRT1/PGC-1α通路分子保护机制;(4)在整体动物层面阐明西红花苷通过SIRT1/PGC-1α通路调节对大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型的保护机制,同时以HT22细胞为研究对象,在细胞层面验证西红花苷对低氧条件下HT22细胞的保护作用,及通过相关通路发挥抗线粒体损伤、抗氧化应激、抗凋亡分子保护机制。方法:1.模型构建:雄性SD大鼠,从海拔2250m通过5小时急进海拔4200m现场建立大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型。通Morris水迷宫实验检测学习和记忆能力;通过HE染色、Nissl染色观察海马组织病理学变化;透射电镜观察海马神经元超微结构的变化;检测脑海马SOD、GSH-Px和MDA表达;TUNEL法检测大鼠脑海马神经元凋亡率。2.西红花苷预处理通过SIRT1/PGC-1α通路调节对大鼠高海拔急性低氧脑海马损伤模型保护机制及最佳剂量筛选:雄性SD大鼠随机分为5组,低海拔对照组(2250m)、急性高海拔低氧组(4200m)、西红花苷低剂量+急性低氧组(25mg/kg/d)、西红花苷中剂量+急性低氧组(50mg/kg/d)、西红花苷高剂量+急性低氧组(100mg/kg/d)。用药组每天肌肉注射西红花苷1次,对照组每天肌肉注射相同体积的0.9%Nacl,连续给药3天后运至高海拔低氧环境(青海省果洛州甘德县,海拔4200米)72小时;Morris水迷宫实验检测学习和记忆能力;HE染色、Nissl染色、透射电镜观察海马组织病理学变化;免疫组织化学法、RT-PCR、Western blot检测脑海马SIRT1、PGC-1α、TFAM、caspases-3、Bcl-2、Bax表达;检测脑海马SOD、GSH-Px和MDA表达及TUNEL法检测大鼠脑海马神经元凋亡率。3.验证西红花苷(100mg/kg/d)预处理对模型大鼠在高海拔急性低氧1、3、5、7天的保护作用及相关分子机制:设立低氧模型组和西红花苷组(100mg/kg/d),利用Morris水迷宫实验检测高海拔低氧1、3、5、7天学习和记忆能力;HE染色、Nissl染色和透射电镜观察海马组织病理学变化;用免疫组织化学法、RT-PCR、Western blot检测低氧1、3、5、7天各组脑海马组织SIRT1、PGC-1α和TFAM、caspases-3、Bcl-2、Bax因子表达;检测高海拔低氧1、3、5、7天各组脑海马SOD、GSH-Px、MDA的水平;TUNEL法检测高海拔低氧1、3、5、7天各组脑海马神经元凋亡水平。4.验证西红花苷对低氧条件下HT22细胞的保护作用及通过SIRT1/PGC-1α通路分子机制:(1)建立(1%O2)低氧HT22细胞损伤模型;(2)通过CCK-8法检测西红花苷(0.001、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)对HT22低氧(1%O2)12、24小时细胞活力影响,明确最佳剂量范围;(3)西红花苷对低氧条件下HT22细胞的保护分子机制:设常氧对照组、低氧(1%O2)组、SIRT1抑制剂(EX-527,100μmol/L)+低氧(1%O2)组、西红花苷25μmol/L+低氧(1%O2)组、西红花苷50μmol/L+低氧(1%O2)组、西红花苷100μmol/L+低氧(1%O2)组,通过透射电镜观察HT22细胞的超微结构变化,通过Western-blot、RT-PCR检测各组的SIRT1、PGC-1α和TFAM、caspases-3、Bcl-2、Bax表达,通过试剂盒检测各组SOD、GSH-Px、MDA的表达及流式细胞技术检测各组细胞调亡率。结果:1.高海拔急性低氧大鼠海马损伤模型构建成功。行为学Morris水迷宫实验显示,模型组寻台潜伏期和行进距离显著增加(P<0.05),而目标象限百分比下降(P<0.05);组织病理学结果显示模型组大鼠海马神经元细胞排列紊乱,核皱缩,局部有溶解性坏死(嗜酸性神经元)而且海马CA1区神经元Nissl染色IOD值明显减低(P<0.05);透射电镜观察发现,模型组大鼠海马CA1区神经元结构欠清晰,线粒体数量明显减少,线粒体高度肿胀并见嵴破坏严重;模型组大鼠脑海马GSHPx和SOD活性明显下降(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),TUNEL染色结果显示,急性高海拔低氧组海马CA1区TUNEL凋亡阳性细胞数明显高于对照组(P<0.05).2.西红花苷(25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d)预处理通过SIRT1/PGC-1α通路对模型组大鼠发挥了保护作用,且呈剂量依赖效应。行为学Morris水迷宫实验显示,西红花预处理组的寻台潜伏期和行进距离显著降低(P<0.05),而目标象限百分比升高(P<0.05),呈剂量依赖性效应(P<0.05);组织病理学结果显示,HE染色显示西红花苷预处理各组均能明显减轻急性高海拔低氧72小时大鼠脑海马神经元病理损伤,Nissl染色显示大鼠海马CA1区神经元IOD值明显升高(P<0.05),透射电镜显示,西红花苷预处理各组大鼠海马CA1区神经元核结构恢复正常,线粒体肿胀减轻,线粒体脊结构均趋于正常,呈剂量依赖性效应;西红花苷预处理能显著提高大鼠脑海马GSHPx和SOD表达,降低MDA含量(P<0.05)同时西红花苷预处理减少凋亡阳性细胞的数量(P<0.05),呈剂量依赖性效应(P<0.05);西红花苷预处理能上调脑海马SIRT1、PGC-1α、TFAM、Bcl-2m RNA和蛋白表达,下调Bax和Caspase-3的表达(P<0.05),呈剂量依赖性效应(P<0.05);结果显示西红花苷(100mg/kg/d)效果最佳。3.西红花苷(100mg/kg/d)对高海拔急性低氧1,3,5天大鼠脑海马神经元的保护作用明显,与SIRT1/PGC-1α通路分子保护机制相关。通过Morris水迷宫实验检测,与低氧模型组比较西红花苷预处理组大鼠急性高海拔低氧第1、3、5天的学习和记忆能力明显提高(P<0.05);通过形态学观察发现急性高海拔低氧环境导致大鼠脑海马区神经细胞排列紊乱,局部有溶解性坏死,线粒体水肿及结构损伤,尤其在第1、3、5天损伤明显,通过西红花苷干预处理也明显减轻神经元及线粒体损伤;西红花苷预处理组能显著提高急性高海拔低氧1、3、5天大鼠脑海马SIRT1、PGC-1α、TFAM、Bcl-2在m RNA和蛋白水平相对表达量(P<0.05),而下调Bax、Caspase-3表达(P<0.05),同时西红花苷预处理能显著提高急性高海拔低氧组1、3、5天大鼠脑海马GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量;西红花苷预处理明显降低急性高海拔低氧1、3、5天大鼠脑海马神经元的凋亡(P<0.05)。4.西红花苷预处理对低氧条件下HT22细胞有明显保护作用与SIRT1/PGC-1α通路分子保护机制相关。透射电镜发现,HT22细胞O2%低氧模型组12、24小时胞质结构松散,核膜皱缩,线粒体肿胀明显,线粒体脊消失,24小时比12小时损伤严重且SIRT1抑制剂+低氧组损伤更明显;西红花苷(25、50、100μmol/L)+低氧组HT22细胞核结构逐渐恢复正常,线粒体和内质网肿胀减轻,线粒体脊结构均趋于正常,呈剂量依赖效应;与对照组相比,低氧组和SIRT1抑制剂+低氧组12、24小时SIRT1、PGC-1α、TFAM、Bcl-2蛋白及m RNA水平表达显著降低(P<0.05),而Bax、Caspase-3蛋白及m RNA表达明显升高(P<0.05),抑制剂+低氧组比低氧组抑制作用更明显(P<0.05);而各西红花苷(25、50、100μmol/L)+低氧组SIRT1、PGC-1α、TFAM、Bcl-2蛋白及m RNA表达显著降低上调,而Bax、Caspase-3蛋白及m RNA表达明显下调(P<0.05),呈剂量依赖表达(P<0.05);与对照组比较低氧组和抑制剂+低氧组12、24小时SOD、GSH-Px活性下降、MDA的表达升高(P<0.05),抑制剂+低氧组比低氧组抑制作用更明显(P<0.05),而各西红花苷(25、50、100μmol/L)+低氧组中SOD、GSH-Px活性明显增强,MDA的下降,呈剂量依赖表达(P<0.05);与对照组比较低氧组和抑制剂+低氧(1%O2)组12、24小时凋亡率明显升高(P<0.05),抑制剂+低氧组比低氧组凋亡率更高(P<0.05),而各西红花苷+低氧组凋亡率明显下降(P<0.05),呈剂量依赖表达(P<0.05)。结论:1.成功构建高海拔急性低氧大鼠海马损伤模型。2.西红花苷(25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d)预处理能明显改善高海拔急性低氧脑海马损伤模型大鼠认知功能障碍,改善脑海马神经元病理损伤,通过调控SIRT1/PGC-1α通路相关因子表达发挥抗线粒体损伤、抗氧化应激、抗凋亡中的作用,呈剂量依赖性效应。3.西红花苷(100mg/kg/d)预处理明显改善高海拔急性低氧第1、3、5天大鼠的学习和记忆能力,明显减轻脑海马神经元病理性损伤,也通过调控SIRT1/PGC-1α通路发挥抗线粒体损伤、抗氧化应激、抗凋亡的作用。4.西红花苷通过调控SIRT1/PGC-1α通路相关因子表达减轻HT22细胞在1%O2条件下12和24小时线粒体结构损伤,发挥抗氧化应激、抗凋亡作用。