研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）,又被称为冠心病,是世界范围内的主要死亡原因之一。冠心病的病理生理学特征为动脉粥样硬化斑块的形成（atherosclerosis,AS）。斑块内反复的脂质沉积、炎性细胞浸润、钙化和内出血等导致冠状动脉管腔狭窄,心肌缺血,引发间歇性或持续性心绞痛。斑块的出血和破裂可导致血栓形成,引起急性心肌梗死。个体患冠心病的风险受基因和生活方式因素之间相互作用的调节。探讨影响冠心病发生发展的分子机制,寻找冠心病潜在治疗靶点,对于冠心病早期干预治疗有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新发现的内源性非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）,其在生物体内广泛存在,因缺少经典线性RNA的5’端帽子和3’端poly（A）尾巴,由共价键结合成闭合环形,故而得名。circRNA的环状结构使其能够耐受核酸外切酶和ribonuclease R（RNase R）降解,半衰期长,比线性RNA更稳定,呈现组织或细胞的特异性表达。同一父本基因（parental gene）可形成不同的circRNA,可由单独的外显子环化（exonic circRNA）、内含子环化（intronic circRNA）或外显子和内含子共同环化（exonic-intronic circRNA,EIciRNA）形成。circRNA的保守性和特异性提示它在基因转录及转录后调控过程中可能发挥重要作用。目前研究发现,在肿瘤、免疫及神经发育等方面,circRNA尤其是外显子来源的exonic circRNA可以作为竞争性内源RNA,通过碱基互补配对的方式与microRNA（miRNA）相结合,抑制miRNA导致的下游靶基因沉默,发挥分子海绵的作用。circRNA在心血管疾病中的研究刚刚起步。有限的研究发现,circRNA通过结合miRNA参与心肌肥厚、心衰及心肌纤维化等的调控。在冠心病中,circRNA参与调控血管内皮及平滑肌细胞的增殖和迁移,可能影响动脉粥样硬化斑块的发展进程。目前,基于少量外周血样本的circRNA芯片检测,发现冠心病患者外周血circRNA表达谱与对照组存在差异。然而通过高通量测序技术对冠心病患者人外周血样本进行circRNA表达谱研究并对差异circRNA在人冠脉组织中进行验证,尚未见文献报道。circRNA是否可以通过吸附miRNA调控其冠心病相关的父本基因的mRNA表达也需进一步研究。研究目的1.探究冠心病患者外周血单核细胞的circRNA表达谱,寻找差异表达的circRNA。2.明确冠心病患者外周血单核细胞中差异显著的circRNA在人动脉粥样硬化冠脉组织中的表达水平。3.探讨 circRNA 及 CHD related parental gene-circRNA-miRNA-mRNA 机制在冠心病发生发展中可能参与的基因调控及功能富集通路。研究方法1.冠心病及对照组外周血样本收集及处理收集2016.01-2017.01于山东大学齐鲁医院住院并行诊断性冠脉介入检查的人群100例,分为冠心病患者组（70例,左主干狭窄＞50%或其他主要心外膜动脉狭窄＞75%）及对照组（30例,冠脉最大狭窄率≤50%）,排除其他系统基础疾病及其他心血管系统疾病。采集外周血5ml,并抽提外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。记录患者年龄、性别、血压、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、糖尿病史、吸烟史、酒精摄入、术前用药等基本信息。2.外周血单核细胞（PBMCs）总RNA抽提及处理Trizol法抽提PBMCs总RNA,吸光度OD260/OD280比值在1.8-2.1之间被认为RNA质量可靠。总RNA经过去除基因组DNA（gDNA）,去除核糖体RNA（rRNA）及去除线性RNA（RNase R消化）处理后,获得3-free RNA。3.高通量测序文库构建RNA检测合格后,加入缓冲液将RNA打断成片段,以短片段RNA为模板,分别依次合成一链cDNA,二链cDNA。随后对纯化的cDNA进行末端修复、加测序接头,并且降解含有U的cDNA第一链,最后进行PCR富集得到链特异性cDNA文库。使用Agilent 2100对文库进行质检。4.circRNA测序及定量分析库检合格后,根据测序说明,应用Illumina Hiseq仪器进行上机测序,获得原始测序序列（Raw reads）。通过数据过滤掉低质量的reads,得到高质量的测序序列（Clean reads）。Clean reads 比对到人类参考基因组（hg38）上,排除连续定位到基因组上的序列,通过findcirc对剩余序列进行分析,基于reads两端能够反向连接匹配到基因组上的基本原理,并排除可能的误差位点,确定识别为circRNA。使用DESeq2软件进行两组间circRNA的差异分析,并获得多重检验后的校正p值（adjusted p-value,padj）。两组间差异倍数≥2或≤0.5,且padj小于0.05的circRNA即被认为是差异显著的circRNA。5.构建 parental gene-circRNA-miRNA-parental mRNA网络通过文献检索,筛选出父本基因（parental gene）与冠心病相关的12个外显子来源的差异circRNA。通过miRanda和TargetScan软件预测circRNA可能结合的miRNA,并进一步从中筛选出可以靶向circRNA父本基因编码的mRNA的miRNA。利用cytoscape软件,对符合条件的前100个节点,构建parental gene-circRNA-miRNA-parental mRNA 网络图。6.生物信息学分析利用 Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）预测circRNA父本基因相关功能,及其可能参与的冠心病相关的信号通路。利用R语言包heatmap.2对前100个差异表达的circRNA进行分析,构建层次聚类图。7.人冠脉组织免疫化学染色大体镜下观察人冠脉组织中斑块大小,分为对照组和动脉粥样硬化组。H＆E染色观察冠脉形态及斑块大小。油红0染色检测斑块内脂质含量。剩余冠脉留作实时定量荧光PCR检测。8.人冠脉组织实时定量荧光PCR（qRT-PCR）Trizol中研磨组织,并抽提总RNA,进一步去除gDNA、rRNA及线性RNA,获得3free RNA。TAKARA逆转录试剂盒进行RT,SYBR Green进行qPCR。使用的引物为根据circRNA接口处设计并验证的特异性引物,GAPDH为内参基因。9.统计分析采用均数±标准差（mean±SD）或者百分比表示数据,应用SPSS 25.0软件进行数据统计分析。两样本间连续变量比较,先进行Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk正态性检验,符合正态分布的使用双尾非配对t检验,不符合正态分布的使用Mann-Whitney U检验。两样本间分类变量比较,采用卡方检验。p＜0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.冠心病患者及对照组基本信息70例冠心病患者及30例对照组入组者年龄、性别、血压、甘油三酯、胆固醇、LDL-C、HDL-C、吸烟史、糖尿病史、酒精摄入、用药史无显著统计学差异。冠心病组患者冠脉最大狭窄百分比为79.21±17.40,对照组冠脉狭窄率为16.67±17.29。2.人冠脉组织基本特征6对人冠脉组织来源于因急性脑损伤致脑死亡的遗体及器官捐献患者。捐献者无其他基础疾病。冠脉组织分为斑块组和对照组,H＆E染色发现斑块组的斑块面积明显高于对照组;油红0染色发现斑块组脂质含量明显高于对照组。3.冠心病组及对照组外周血单核细胞circRNA表达谱通过对70例冠心病组及30例对照组PBMCs样本进行测序,发现24,364个circRNAs在两组中均有表达,22,568个circRNAs只在一组中测出。在所有的circRNAs中,外显子来源的circRNA占59%。与对照组相比,2283个circRNAs在冠心病组表达明显下调,85个circRNAs在冠心病组表达明显上调。差异circRNA的来源基因分布在除Y染色体以外的其他所有染色体上。对差异表达前100的circRNA进行分层聚类分析,显示冠心病组和对照组circRNA表达存在明显差异。4.冠心病差异表达circRNA的生物信息学分析分别对差异表达的circRNA（70个显著下调和30个显著上调的circRNAs）的父本基因进行生物信息学分析。GO分析发现下调的circRNA父本基因主要在细胞器组成、胞内蛋白代谢和蛋白修饰等生物过程富集;主要在胞内和核质富集;且主要在蛋白结合等分子功能富集。KEGG分析发现,下调的circRNA父本基因主要在MAPK,FOXO,T细胞受体和β细胞受体等信号通路富集。5.冠心病相关的 parental gene-circRNA-miRNA-parental mRNA 网络图构建及生物信息学分析通过文献检索,发现12个外显子来源的circRNA,其父本基因与冠心病相关。通过软件预测发现,这12个circRNA上均存在多个miRNA结合位点,且部分miRNA的靶基因包括circRNA父本基因编码的mRNA。由此构建parental gene-circRNA-miRNA-parental mRNA网络图。提示circRNA可能通过吸附miRNA调控其父本基因,影响CHD的发生发展。同时通过对每个circRNA吸附的top5 miRNA进行KEGG分析,发现circRNA除可能调控其父本基因外,还在p53信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号通路、血管平滑肌收缩信号通路和Ras信号通路等心血管相关疾病通路中富集。6.人冠脉组织中circRNA实时定量荧光检测结果在12个筛选出的差异circRNA中,构建8个circRNA的接口处特异性引物,并对PCR扩增产物进行测序,证明引物的有效性。在六对有斑块和无斑块的冠脉组织内检测的8个circRNA中,6个circRNA差异趋势与PBMCs测序结果一致。7.几个circRNA可能通过吸附相同的miRNA共同参与功能调控在人冠脉组织中验证的8个circRNA中,软件预测发现hsacirc0066187,hsacirc0030042 和 hsacirc0003915 同时存在 miR-30c-1-3p 和 miR-30c-2-3p的结合位点,可能共同参与脂肪酸合成、代谢和TGF-β信号通路,调控CHD的病理生理改变。结论1.circRNA在冠心病患者外周血单核细胞中存在表达异常;2.冠心病患者外周血单核细胞中差异显著的circRNA在人动脉粥样硬化冠脉组织中的表达水平与测序结果的差异趋势基本一致;3.冠心病相关parental gene-circRNA-miRNA-parental mRNA轴可能在 circRNA调控冠状动脉粥样硬化病理生理变化中发挥作用。研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）斑块的形成和不稳定是冠心病的病理生理学基础。ox-LDL通过与细胞膜上的LOX-1、SR-B1等受体结合,激活炎症反应、泡沫细胞形成和细胞凋亡等一系列的促动脉粥样硬化过程,推动AS的发生发展。内皮细胞功能损害不仅是AS的起始表现,在AS发生发展中也起到极为重要的作用。高浓度的ox-LDL能够激活内皮细胞的异常自噬,表现为beclin1表达异常增加、自噬激活和自噬溶酶体降解异常导致的自噬流阻滞。尽管自噬过程被认为可以清除细胞内脂质修饰的细胞成分,但异常自噬导致的内皮细胞的死亡和丢失可能导致晚期斑块的不稳定性、血小板粘附增加和加速血栓形成。因此,减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞异常自噬,可能成为稳定斑块的潜在靶点。Beclin1是自噬起始的重要蛋白。已有文献报道,beclin1与胚胎发育过程中及ox-LDL诱导血管内皮细胞异常自噬过程中细胞表面磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）暴露增加相关,PS暴露是细胞凋亡的指标,可以导致细胞被识别清除。FOXO1是血管内皮细胞中多种致动脉粥样硬化通路中的共同转录因子,其广泛参与调控细胞周期、细胞凋亡、自噬及氧化应激等多方面功能。在糖尿病模型中,FOXO1能够抑制自噬过程中自噬体与溶酶体结合,导致内皮细胞自噬性凋亡。在论文的第一部分临床标本研究中,我们通过对冠心病患者外周血单核细胞进行测序及人冠脉组织内验证,发现circ0030042（hsacirc0030042）在冠心病患者中表达明显下调。circBase数据库显示FOXO1来源的hsacirc0030042基因组长度为1352碱基,切割后长度为1352nt,完全由外显子来源。并且在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞中,hsacirc0030042测序丰度较高,而小鼠FOXO1来源的mmucirc0010680与人的序列高度一致,同源性较高,提示该circRNA的保守性及组织特异性较高。circ0030042是否参与内皮细胞功能调节尚未可知。已知circRNA在生物体内能够作为内源性竞争性RNA（ceRNA）发挥转录及转录后水平调控作用,我们通过软件分析发现,circ0030042可能包含RNA结合蛋白Ago2、eIF4A3和HuR的结合位点,其中eIF4A3与转录和翻译调控密切相关。circ0030042是否具有ceRNA功能并通过调节其父本基因FOXO1及其他自噬相关蛋白改善ox-LDL诱导的内皮细胞异常自噬需深入研究。研究目的1.明确在ox-LDL刺激下,circ0030042在内皮细胞中的变化规律;2.探讨circ0030042是否参与调控ox-LDL诱导的内皮细胞异常自噬;3.探讨circ0030042调控自噬相关蛋白beclin1和FOXO1的分子机制。研究方法1.HUVECs细胞培养及ox-LDL的时间梯度干预HUVECs 37℃,5%CO2培养,隔天传代。对4-8代的HUVECs分别给予100ug/ml浓度的ox-LDL刺激0、3、6、12、24h。qRT-PCR检测ox-LDL不同刺激时间对circ0030042 表达的影响。Western blot 检测 ox-LDL 对 FOXO1、beclin1、p62和LC3B表达的影响。2.通过慢病毒转染构建circ0030042稳定过表达的HUVECs构建含有成环元件且含有GFP元件的对照慢病毒（pLO-ciR）和含有成环元件但无GFP元件的circ0030042过表达慢病毒（pLCDH-c0030042）,选择合适的转染复数（MOI=10）侵染2代HUVECs,并通过1ug/ml嘌呤霉素连续筛选获得稳定过表达 circ0030042 的 HUVECs（circ0030042）及对照细胞（circ-N.C）。通过观察对照组荧光表达、PCR产物测序、并使用circ0030042接口处特异性反向扩增引物（divergent primer）进行qRT-PCR,证实circ0030042过表达有效,且在HUVECs中稳定成环。3.e IF4A3过表达慢病毒转染HUVECs构建对照慢病毒（HBLV-GFP-PURO）和eIF4A3过表达慢病毒（HBLV-h-eIF4A3-GFP-PURO）,选择合适的转染复数（M0I=10）侵染HUVECs,72h后通过观察细胞荧光表达、进行western blot,证实eIF4A3过表达有效。4.LC3自噬双标腺病毒转染LC3自噬双标腺病毒（stubRFP-sensGFP-LC3）购自上海吉凯生物公司,用于观察细胞自噬流水平。在细胞融合率达到40%-50%进行转染,病毒冰上溶解后,选择MOI=25转染目的细胞。转染72h后共聚焦显微镜观察红、绿荧光表达水平,并进行下一步实验。5.siRNA细胞转染当细胞融合度达到40%-50%时,换用无血清无双抗的培养基,使用lipo3000将特异性的siRNA及对照无义干扰RNA转染至目的细胞中。转染6h后换用完全培养基,继续培养24-48h后qRT-PCR及western blot检测干扰效率或进行下一步实验处理。6.circ0030042-eIF4A3 结合位点敲除的circ0030042 质粒（circ-delete）转染通过软件预测,circ0030042序列上主要可能有3个eIF4A3蛋白的结合位点（180-227,812-867,和 1082-1137 核苷酸）。我们敲除了 circ0030042 上 3个结合位点,并利用敲除后的序列构建了过表达部分circ0030042序列的质粒（circ-delete）,其成环接口处序列与原完整circ0030042过表达质粒（pLCDH-c0030042）一致。使用lipo3000将过表达部分circ0030042序列的质粒（circ-delete）及过表达circ0030042完整序列的质粒转染至目的细胞中。7.RNA 印记杂交（northern blot）Trizol法抽提细胞总RNA,选择性RNase R处理,经过RNA变性、电泳、转膜后,采用地高辛标记的、根据接口处设计的circ0030042特异性互补探针,及地高辛标记的GAPDH对照探针进行预杂交、杂交、洗膜及压片等步骤完成。8.蛋白质印记杂交（western blot）根据实验目的,采用RIPA抽提细胞总蛋白或试剂盒分别抽提细胞核/浆蛋白。加入蛋白上样缓冲液后,99℃变性5min。经过上样、电泳、转膜、封闭、4℃一抗杂交过夜、室温二抗杂交1h后进行化学发光。GAPDH作为内参蛋白,photoshop软件进行结果分析。9.RNA和gDNA抽提及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）采用Trizol法抽提总RNA,根据要求去除rRNA和线性RNA,TAKARA逆转录试剂盒进行RT,SYBR Green进行qPCR。使用的circ0030042引物为根据接口处设计并验证的特异性反向扩增引物,其他基因引物为正常设计引物,GAPDH为内参基因。qPCR产物根据需要用于进一步琼脂糖凝胶电泳检测。采用TAKARA基因组DNA抽提试剂盒提取细胞gDNA。采用circ0030042特异性的反向扩增引物（divergent primer）和对向扩增引物（convergent primer）分别进行PCR扩增;采用GAPDH对向扩增引物和反向扩增引物进行PCR扩增,作为对照。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。10.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）4%多聚甲醛固定HUVECs,0.5%Triton X-100通透细胞后,采用circ0030042特异性荧光杂交探针及18s rRNA荧光杂交探针分别与样本杂交,37℃过夜,DAPI染核后,采用激光共聚焦显微镜检测circ0030042胞内分布。11.RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprec ip i tat ion,RiP）分别利用eIF4A3、Ago2和HuR蛋白的特异性RIP级别抗体,IgG抗体作为对照。采用Millipore RIP检测试剂盒中裂解液裂解HUVECs,取上清加入核酸酶抑制剂。进一步与抗体孵育好的磁珠混合后4℃旋转过夜。磁珠复合物反复洗涤后利用蛋白酶K和氯仿进行RNA的纯化和抽提,产物-80℃沉降过夜可用于进一步RNA检测。12.自噬的电镜检测收集待检细胞,离心弃上清液,PBS重悬后,再离心弃上清液。用电镜固定液固定、脱水后将细胞包埋入包埋剂中。在超薄切片机上切取薄片。切片染色后用日立透射电子显微镜在80kv下扫描切片。13.细胞免疫荧光目的细胞铺于24孔板中,处理时细胞融合度达到70-80%。4%多聚甲醛室温固定后,0.5%Triton-X-100通透细胞,并在37℃下封闭。滴加一抗4℃孵育过夜,然后使用荧光二抗37℃孵育1h,DAPI染核。共聚焦显微镜采集图像。14.PE/7-AAD流式细胞术检测细胞表面PS使用BD Annexin V PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测细胞表面PS暴露。依照说明,消化细胞并洗涤离心后,按照分组加入结合底物和染剂,避光孵育15min,立即上机检测并分析。15.放线菌素D处理后检测mRNA稳定性为阻断新mRNA的合成,分别使用10 μg/ml放线菌素D处理目的细胞0h、3h、6h、9h和12h后,qRT-PCR检测不同分组中mRNA的剩余量。16.统计分析采用均数±标准差（mean±SD）表示数据,应用SPSS 25.0软件进行数据统计分析。连续变量比较,先进行Shapiro-Wilk正态性检验,符合正态分布的两组间比较使用双尾非配对t检验,不符合正态分布的使用Mann-Whitney U检验。多样本组间比较采用one-way或two-way ANOVA 比较。p＜0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.circ0030042在circBase中信息及人鼠同源性比较circBase 数据库显示 FOXO1 来源的人 circ0030042（hsacirc0030042）基因组长度为1352碱基,切割后长度为1352nt,完全由2号外显子来源。并且在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中,hsacirc0030042测序丰度较高,而小鼠FOXO1来源的mmucirc0010680与人的序列89%一致,同源性较高。2.验证circ0030042反向扩增引物有效且环状的c i rc0030042在HUVECs中分布通过抽提HUVECs 的3free RNA（反转录为cDNA）及gDNA,分别采用circ0030042和GAPDH的反向扩增引物（divergent primer）及对向扩增引物（convergent primer）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果提示HUVECs中circ0030042存在且divergent primer可用于后续检测。在人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）、人单核细胞（THP-1）和 HUVECs 中,circ0030042 和 FOXO1 均在HUVECs 中丰度较高。Northern blot 和 FISH 结果提示,HUVECs 中 circ0030042以成环方式存在,且主要分布于细胞质中。3.ci rc0030042 能够吸附 eIF4A3RIP实验证实circ0030042能够吸附Ago2和eIF4A3,其中eIF4A3丰度较高。软件预测发现,circ0030042上主要有3个eIF4A3的结合位点（180-227,812-867,1082-1137 位碱基）,可能与 eIF4A3 上 5 个结合域（61-112,111-162,176-227,251-302,336-387位氨基酸）相结合,且人鼠eIF4A3的5个结合域完全一致。4.ox-LDL能够下调HUVECs中circ0030042表达,诱导自噬相关becl in1和FOX01蛋白表达给予不同时间的100ug/ml ox-LDL刺激HUVECs,与对照组相比,100ug/ml ox-LDL能够持续明显下调HUVECs中circ0030042表达水平。Western blot显示,与Oh对照组相比,100ug/ml ox-LDL刺激HUVECs 3h能够明显上调beclin1和FOXO1蛋白表达,刺激24h能够明显上调LC3B表达,ox-LDL对eIF4A3蛋白表达无明显影响。5.circ0030042 稳定过表达 HUVECs（c0030042）构建成功为减少后续实验干扰,构建的circ0030042过表达慢病毒无GFP荧光元件,对照慢病毒质粒包含GFP荧光元件。转染并嘌呤霉素筛选HUVECs后,检测对照组荧光表达率超过95%。PCR产物测序证明过表达的circ0030042成环接口处序列准确;qRT-PCR检测证实与对照病毒组相比,circ0030042过表达超过40倍。6.circ0030042能够抑制ox-LDL诱导的HUVECs异常自噬自噬双标LC3腺病毒转染显示,与0h对照组相比,ox-LDL刺激HUVECs 3h,24h均能够明显引起胞内自噬体聚集,而c0030042组细胞自噬体聚集被抑制。流式检测显示,与0h对照组相比,ox-LDL刺激24h能够明显增加细胞表面PS表达,而c0030042组细胞表面PS表达降低。进一步western blot显示,过表达circ0030042能够抑制ox-LDL对FOXO1、beclin1和LC3B的上调作用,而干扰circ0030042能够明显上调FOXO1、beclin1和LC3B的蛋白表达,二者均对eIF4A3蛋白表达无明显影响。7.circ0030042能够通过吸附eIF4A3抑制FOXO1和beclin1表达Western blot显示,与阴性对照组相比,eIF4A3干扰能够明显抑制FOXO1、beclin1和LC3B蛋白表达;且在circ0030042过表达组中,eIF4A3干扰能够进一步抑制FOXO1、beclin1和LC3B表达,电镜检测同样显示eIF4A3干扰后自噬体减少。与空载体对照组相比,eIF4A3过表达能够明显增加FOXO1、beclin1和LC3B蛋白表达;且在circ0030042过表达组中,eIF4A3过表达能够降低circ0030042对FOXO1、beclin1和LC3B的抑制作用。RIP显示,与空载体对照组相比,circ0030042过表达组中beclin1、FOXO1 mRNA上eIF4A3蛋白结合明显较少,circ0030042上eIF4A3蛋白结合明显增加。核浆蛋白western blot和细胞免疫荧光结果显示,与空载体对照组相比,circ0030042过表达组中eIF4A3胞质分布增多,可能与circ0030042主要分布于细胞质中有关。通过转染敲除了circ0030042与eIF4A3的3个主要结合位点的circ-delete质粒,RIP显示与c0030042 组相比,circ-delete 组 eIF4A3 上 circ0030042 明显较少;western blot 显示与 c0030042 组相比,circ-delete 组 FOXO1、beclin1 和 LC3B 均表达上调。放线菌素D实验结果显示eIF4A3干扰和circ0030042过表达均能够降低FOXO1和beclin1 mRNA稳定性,eIF4A3过表达能够缓解circ0030042过表达后对FOXO1和beclin1 mRNA的负性影响。结论1.ox-LDL 能够抑制 HUVECs 中 circ0030042 表达;2.circ0030042能够抑制becl in1和FOXO1蛋白表达,减轻ox-LDL诱导的HUVECs异常自噬;3.circ0030042通过吸附eIF4A3,减少其与beclin1和FOXO1 mRNA结合,抑制beclin1和FOXO1蛋白表达。研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是最主要的动脉硬化性血管病变。AS特征为进行性的动脉壁纤维脂肪病变的形成,引起心肌梗死、脑卒中以及致残性的周围动脉疾病,在世界范围内拥有高发病率和高死亡率。AS病变发展的危险因素包括高脂、高胆固醇、高血压、吸烟、糖尿病和免疫炎症等。关于AS的细胞和分子生物学研究为深入了解所有这些危险因素与AS的发生和临床表现之间的联系提供了重要的线索。AS的发病过程可分为三个阶段:起始、进展和并发症阶段。内皮细胞血管内膜的主要组成细胞,在生理情况下,血管内皮细胞通过屏障作用、分泌细胞因子、调控血管收缩舒张、抑制血小板黏附等发挥保护血管的作用。在AS病变的起始和进展阶段,低密度脂蛋白（LDL）经过氧化和其他修饰后,聚集在内膜中发挥促炎症和促免疫反应的作用,引起内皮细胞损伤。受损的内皮细胞稳态被破坏,可激活多种促炎因子表达,一方面,趋化循环中单核细胞黏附进入内膜,转化为利于吞噬脂质颗粒的巨噬细胞,巨噬细胞可通过清道夫受体吞噬脂蛋白颗粒变成泡沫细胞,逐渐沉积于内膜下形成脂核;另一方面,内皮细胞分泌的促炎因子还可作用与血管中膜的平滑肌细胞,导致平滑肌细胞向斑块区域的增殖迁移,表型由收缩型向分泌型转变,进一步促进炎症因子的分泌,促进AS进展。在AS的并发症阶段,血管内皮细胞凋亡增加导致组织因子释放,促进血小板黏附及血栓形成,造成急性冠脉综合征和脑卒中。由此可见,内皮细胞功能调节对稳定斑块、减少急性心血管事件,具有重要作用。有关环状RNA（circular RNA,circRNA）体内调控AS的研究尚未见报道。在论文的第一部分临床标本研究中,我们发现circ0030042在对照组中的表达明显高于冠心病患者。在第二部分体外实验中,我们发现,circ0030042能够吸附eIF4A3,抑制ox-LDL引起的血管内皮细胞异常自噬,减少内皮细胞自噬性凋亡。在本部分中,我们将在AS模型小鼠中,对circ0030042是否能通过抑制自噬,调控内皮细胞功能,发挥稳定AS斑块的作用及相关机制进行研究。研究目的1.探讨circ0030042及eIF4A3对ApoE-/-小鼠血脂、血糖及血浆炎症水平的影响;2.明确circ0030042及eIF4A3对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块组织形态及斑块稳定性的作用;3.观察circ0030042及eIF4A3对斑块内自噬相关蛋白beclin1和FOXO1的影响,及对血管内皮功能的影响。研究方法1.动物分组100只8周龄ApoE-/-雄性小鼠,2周适应饮食后,高脂喂养（西方饮食模型）10周后,随机分4组,行尾静脉注射:（1）GFP-N.C组（n=25）:200ul 2×108TU/ml 空载体病毒;（2）c0030042 组（n=25）:200ul 2×108TU/ml circ0030042 过表达慢病毒;（3）h-eIF4A3-GFP 组（n=25）:200ul 2×108TU/ml人 eIF4A3 过表达慢病毒;（4）c0030042+h-eIF4A3 组（n=25）:200ul 2×108TU/ml circ0030042和人eIF4A3过表达慢病毒混合液。继续高脂喂养6周后取材。2.动物取材小鼠麻醉,取血浆,检测TG、TC、LDL-C、HDL-C及血糖水平。取材颈动脉、心脏及主动脉全长,根据需要液氮（-80℃）保存或4%甲醛固定24h后,OCT包埋,5um连续切片。3.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）4%多聚甲醛固定切片,0.5%Triton X-100通透后,采用circ0030042特异性荧光杂交探针及18s rRNA荧光杂交探针分别与样本杂交,37℃过夜,DAPI染核后,采用激光共聚焦显微镜检测circ0030042在组织内分布。4.组织蛋白提取取主动脉全长,利用invent血管组织总蛋白提取试剂盒,物理研磨,裂解消化,离心抽提,煮沸变性。5.蛋白质印记杂交（western blot）经过上样（20ul/孔）、电泳、转膜、封闭、4℃一抗杂交过夜、室温二抗杂交1h后进行化学发光。GAPDH作为内参蛋白,photoshop软件进行结果分析。6.大体油红0染色主动脉显微镜下剥净外膜,纵向剖开。油红0染液37℃染色2h,温水浸泡血管脱浮色,展平拍照。7.主动脉根部斑块冰冻切片染色H＆E染色观察血管形态及斑块大小;油红0染色检测脂质含量;Masson染色观察血管胶原含量;免疫组织化学染色检测巨噬细胞（MOMA-2）、平滑肌细胞（α-SMA）含量。计算易损指数:（巨噬细胞含量%+脂质含量%）/（平滑肌细胞含量%+胶原含量%）。免疫组化染色检测黏附分子（ICAM、VCAM）和自噬相关蛋白（FOX01、beclin1、LC3B 和 eIF4A3）表达。8.ELISA分离小鼠血浆,应用IL-1β、MCP-1和IL-6 ELISA试剂盒,使用酶标仪在450nm和570nm分别记录吸光度值。9.动脉环实验冰上取材颈动脉置于缓冲液,立即置于血管张力检测仪上,平衡预刺激血管,去甲肾上腺素（NE）刺激血管至收缩最大值后,10-9,10-8和10-7mo1/L乙酰胆碱（Ach）分别刺激血管,并记录舒张张力值。10.统计分析采用均数±标准差（mean±SD）表示数据,应用SPSS 25.0软件进行数据统计分析。连续变量比较,先进行Shapiro-Wilk正态性检验,符合正态分布的两组间比较使用双尾非配对t检验,不符合正态分布的使用Mann-Whitney U检验。多样本组间比较采用one-way或two-way ANOVA 比较。p＜0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.实验动物一般情况四组（GFP-N.C 组、c0030042 组、h-eIF4A3-GFP 组、c0030042+h-eIF4A3 组）的ApoE-/-小鼠的血浆TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖均无显著统计学差异,说明circ0030042和eIF4A3不影响血脂和血糖。与GFP-N.C组相比,c0030042组血浆IL-1β、MCP-1表达显著下调,说明circ0030042能够改善炎症水平。2.慢病毒转染效率检测慢病毒转染6周后主动脉根部取材切片,采用circ0030042特异性探针进行组织原位杂交,结果显示与GFP-N.C组相比,c0030042组斑块内circ0030042表达明显增加,说明过表达circ0030042有效。慢病毒转染6周后取整根主动脉,western blot显示与GFP-N.C组相比,h-eIF4A3-GFP组eIF4A3蛋白表达显著增加,说明过表达eIF4A3有效。3.circ0030042 抑制斑块内 FOXO1、beelin1 和 LC3B 表达免疫组化和western blot结果显示,与GFP-N.C组相比,c0030042组斑块内 FOXO1、beclin1 和 LC3B 表达减少;与 GFP-N.C组相比,h-eIF4A3-GFP 组斑块内 FOXO1、beclin1 和 LC3B 表达增加;与 h-eIF4A3-GFP 组相比,c0030042+h-eIF4A3组斑块内FOXO1、beclin1和LC3B表达明显减少。4.circ0030042减少主动脉整体斑块脂质沉积大体油红0及主动脉不同节段切片油红0结果显示,与GFP-N.C组相比,c0030042组主动脉脂质沉积显著降低;与GFP-N.C组相比,h-eIF4A3-GFP组主动脉脂质沉积显著增加;与h-eIF4A3-GFP组相比,c0030042+h-eIF4A3组主动脉脂质沉积显著改善。5.circ0030042增加主动脉根部斑块稳定性与GFP-N.C组相比,c0030042组主动脉根部斑块大小无明显差异;胶原含量明显增加,斑块易损指数下降;与GFP-N.C组相比,h-eIF4A3-GFP组胶原含量明显减少,脂质含量显著增加,斑块易损指数上升;与h-eIF4A3-GFP组相比,c0030042+h-eIF4A3组斑块内胶原含量明显增加,脂质含量显著减少,斑块易损指数改善。6.circ0030042改善血管内皮功能免疫组化及血管环实验结果显示,与GFP-N.C组相比,c0030042组内皮表面黏附分子（ICAM、VCAM）分泌明显减少,内皮依赖的血管舒张最大百分比增加;与GFP-N.C组相比,h-eIF4A3-GFP组内皮表面黏附分子（ICAM、VCAM）分泌明显增加,内皮依赖的血管舒张最大百分比降低;与h-eIF4A3-GFP组相比,c0030042+h-eIF4A3组ICAM、VCAM分泌明显减少且血管舒张最大百分比显著改善。结论1.circ0030042减少动脉粥样硬化斑块的脂质聚集面积,增加胶原含量,提高斑块稳定性,对抗eIF4A3的促斑块易损性的作用;2.circ0030042能够改善ApoE-/-小鼠炎症水平,但对血脂、血糖水平无明显影响;3.circ0030042拮抗eIF4A3作用,抑制斑块内beclin1和FOXO1表达,改善血管内皮功能。