研究背景和目的：胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在国内外发病率均较高。世界范围内其死亡率高居恶性肿瘤的第2位。胃癌发病与多种因素有关,考虑为环境与基因因素复杂的交互作用。然而,具体的发病机制仍需进一步阐明。胃癌的诊断主要依靠胃十二指肠镜检结合组织学病理检测。病理类型以腺癌为主,根据浸润深度分为早期胃癌,进展期胃癌。在我国,早期胃癌的检出率低,临床确诊的病例多为进展期胃癌。胃癌的治疗目前是以胃癌根治术为基础的综合治疗。早期胃癌预后较好,手术治疗后5年生存率可以达到90%以上,但是进展期胃癌术后容易复发转移,预后差,死亡率高。为提高疗效,术后多需辅助放化疗治疗。胃癌细胞对放射治疗敏感性低,目前临床上多不主张术前放疗,仍以化疗为主。虽然近年来不断有化疗药物的更新换代及一些新的观念与治疗措施如术前新辅助化疗、术中化疗等出现,辅助治疗的效果并未出现根本性的改观,中晚期患者5年生存率并未得到明显改善。因此,更加深入的探索胃癌的发生发展机制以及探寻更加有效的治疗措施显得更为重要。正常胃上皮细胞恶变的分子基础为胃正常粘膜上皮细胞增殖与凋亡的失衡,而其平衡则依赖大量癌基因、抑癌基因以及细胞因子等的调控。由于]miRNA分子在调控癌基因、抑癌基因方面的功能逐渐被人们所认识,目前miRNA是肿瘤研究的热点之一。研究表明miRNA是高度保守的内源性非编码单链RNA,这类RNAs长度约19-25核苷酸。他们的初级转录产物经过一系列核酸酶的剪切加工后形成成熟miRNA分子,进而参与早期胚胎发育、细胞分化、细胞增殖与凋亡、细胞代谢等重要的生理过程。miRNA发生生物学效应需要通过与靶基因结合,结合后可以诱导靶基因的降解或者翻译抑制,进而参与到广泛的生理过程。研究发现miRNA与肿瘤的发生发展及预后关系密切。miRNA可以是原癌基因,也可以是抑癌基因。主要看他们的靶基因在具体的细胞或者组织中执行什么样的功能。因此,miRNA通过调控靶基因(癌基因及抑癌基因)的表达,从而调控细胞增殖、分化、凋亡。miRNA调控靶基因的机制十分复杂,各种调控途径形成调控网络,从而协同促进或抑制肿瘤的发生。MiRNA的异常表达可以由多种因素引起,比如甲基化、基因缺陷、基因突变、异常转录以及基因片段丢失或异常扩增等。由于miRNA的靶基因可以是原癌或抑癌基因或者是重要的细胞周期进程、分化或凋亡的基因,因此异常表达的miRNA便通过异常的正向或者反向基因调控,来直接调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡,并参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。研究表明多种miRNA分子在胃癌组织中相对于癌旁正常组织表达异常。表达异常的miRNA分子通过作用于其靶基因,广泛参与到胃癌的发生发展过程当中。如miR-21在超过92%的胃癌病人中表达上调,同时除了胃癌组织外,在幽门螺杆菌感染的胃炎组织中也可以观察到miR-21表达的显著上调。鉴于幽门螺杆菌感染的萎缩性胃炎是明确的癌前病变。我们猜测miR-21在幽门螺杆菌介导的胃粘膜细胞癌变过程中发挥作用,虽然其机制并未阐明。miR-125b,miR-199a以及miR-100是目前发现的最重要的与胃癌细胞增殖关系密切的miRNA分子。也有研究发现miR-32,miR-182以及miR-143分子与肠型胃癌的发生特异相关。提示miRNA的表达谱可能与肿瘤的不同分型有关,从而使miRNA作为胃癌不同亚型区分的分子标记物成为可能。miR-143,miR-145,miR-9,miR-443,miR-31,还有miR-34在胃癌组织中表达下调,其异常表达与胃癌细胞增殖有关。虽然]miRNA自问世以来一直是研究的热门,由于miRNA分子种类繁多,在胃癌中仍有可能存在未被研究过的或是机制未被彻底阐明的miRNA分子。通过高通量的miRNA芯片技术,筛选出胃癌组织中异常表达的miRNA分子,并研究其生物学功能及调控机制。目的在于发现临床意义明显,能显著影响胃癌生物学效应的miRNA,为胃癌的诊断,生物靶向治疗或预后判断提供有价值的信息。miR-34a、miR-335分子在胃癌组织中通常低表达。在胃癌中,功能上两者被认为属于抑癌基因。有研究报道,miR-335可以通过作用于其靶基因Bcl-W以及SP1,抑制胃癌细胞的侵袭、转移能力；而miR-34a可以靶向调控PDGFR及MET表达,进而抑制胃癌的增殖。然而,由于mircoRNA分子具有多目标靶点的特性,一种]miRNA通常可以靶向多种目标mRNAs结合,一种目标mRNA也可以被多种miRNAs调节,形成复杂的调控网络。具体调控机制并没有被研究透彻。Survivin,1997年新发现的凋亡抑制基因BIRC5,其表达产物Survivin蛋白由142个氨基酸组成,是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的最小成员。目前研究表明survivin功能主要表现为两个方面,抑制细胞凋亡,调节细胞周期,同时参与到肿瘤新生血管的生成。survivin在人类几乎所有的恶性肿瘤中均处于高表达状态。由于survivin在肿瘤组织中的高表达有高度特异性,一般认为survivin是恶性肿瘤细胞生存所必需的。已有研究证实了survivin参与了肿瘤细胞的恶变和抗凋亡的生理过程。因此,survivin被认为是抗肿瘤治疗的一个重要靶点。在胃癌中,survivin的表达同样显著上调,其表达量是一个重要的预后和病理分级的指标。有大量研究报道survivin基因在胃癌增殖、侵袭、转移、细胞凋亡或肿瘤新生血管生成中的重要调节作用,但是其上游调控通路并不甚清楚,有研究证实,survivin在胃癌中的表达水平受到miRNA的调控,如miR-34a等。在胃癌组织中,miR-34a、miR-335的低表达,survivin的高表达,两者之间是否存在一定的联系。查阅文献,miR-34a通过相应的信号转导通路可以抑制survivin基因的表达。另外一项研究发现,miR-34a可以直接作用于转录因子E2F2,来调控survivin基因的表达。那么miR-335是否具有相似的调控机制。根据生物信息学网站预测,miR-335与survivin mRNA 3’UTR存在可能的结合位点。因此,miR-34a、miR-335可能具有共同的靶基因,survivin。鉴于survivin是知名而且重要的癌基因,并且在胃癌发生发展中发挥重要的作用。因而选取这两个miRNA分子作为本次研究的目标miRNA。本研究目的探索miR-34a、miR-335在胃癌中的生物学功能,并研究其调控机制。miR-34a、miR-335是否可以共同作用于survivin基因,进而调控胃癌细胞的增殖、凋亡及侵袭。同时通过研究miR-34a、miR-335在胃癌组织中的表达水平与病人临床病理特征及总体生存率的关系,探索这两个miRNA分子可能的临床价值及意义。"miR-34a/335-survivin-gastric cancer"调控通路的研究有助于深化认识胃癌发病的分子机制,同时为胃癌的生物治疗提供新的潜在的靶点。方法：1.临床获取8例胃癌组织及相应的癌旁正常组织标本,利用高通量的miRNA芯片技术(Agilent)检测胃癌组织中异常表达的miRNA分子,结合文献报道,既往研究结果,从中选出本次研究的目标miRNA,即miR-34a、miR-335分子。2.生物信息学软件预测miR-335与survivin mRNA 3’UTR存在可能的结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验验证该结合位点。首先根据预测的结合位点,构建相应的荧光质粒报告基因载体(包括野生型及突变型)。在HEK 293T细胞株中通过脂质体瞬时转染的方式共转染miR-335 mimic或negative control与构建的质粒,24h后检测荧光素酶活性的变化。双荧光素酶报告基因实验是经典的用于miRNA与靶基因结合验证的实验方法,同时检测萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性,海肾荧光素酶作为第二报告基因,起到了减少实验误差的作用。在胃癌细胞株SGC-7901中重复以上实验,进一步验证结论的可靠性。3.研究miR-34a、miR-335对其靶基因survivin表达的调控作用。首先利用qRT-PCR技术分别检测在正常胃粘膜上皮细胞株GES-1,及四种胃癌细胞株AGS,BGC-823,MGC-803,以及SGC-7901中,miR-34a及miR-335的表达水平。从中选出miR-34a及miR-335相对高表达的AGS以及相对低表达的SGC-7901两种胃癌细胞株进行后续的研究。通过在胃癌细胞株SGC-7901中脂质体瞬时转染miR-34a、miR-335 mimics的方式过表达miR-34a、miR-335,通过转染miR-34a、miR-335抗体的方式下调miR-34a、miR-335表达。利用qRT-PCR技术、westernblot实验分别检测转染后survivin基因在mRNA及蛋白水平的表达变化。4.在胃癌细胞株SGC-7901中分别利用CCK-8、flow cytometry、transwell实验研究miR-34a、miR-335对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响。明确miR-34a、miR-335生物学效应后,在此实验的基础上,进一步探索其调控机制。共转染miR-34a或miR-335与pcDNA3.1-survivin(经过基因修饰的不表达3’UTR的survivin后,再次检测上述生物学效应的变化。由于此survivin不表达3’UTR,不存在与miRNA结合的位点。其检测结果从反面证实了miR-34a/335发挥作用需要与survivn基因发生特异性结合。5.临床获取50例胃癌病人组织标本,利用qRT-PCR技术检测miR-34a、miR-335表达水平,并根据中位值将其分为相对高表达组及相对低表达组,观察两组病人间临床病理资料如性别、年龄、组织学类型、临床病理分期、淋巴结转移等方面有无差别；术后常规随访60个月,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察比较两组病人术后总体生存率,并检验两组曲线差异有无统计学差异。统计学处理：统计学处理用SPSS18.0软件进行,胃癌组织与癌旁正常组织中miR-34a、miR-335表达水平的比较利用Paired Wilcoxon test,根据miR-34a、miR-335表达水平中位值,将50例胃癌病人分为高表达组及低表达组。用Kaplan=Meier统计方法绘制两组病人生存曲线,两组曲线的比较利用log-rank方法检验差异有无统计学意义。miR-34a、miR-335表达水平与临床病理资料对比分析利用Pearson’s x2检验。组间均数的比较利用非配对的t检验。P<0.05被认为有统计学意义。结果：1.根据Agilent miRNA芯片检测结果筛选出胃癌与癌旁组织中表达差异最明显的12个miRNA分子(入选标准为表达差异≥3倍),其中6个表达上调,6个表达下调。查阅文献,miR-34a可以通过与转录因子E2F2结合间接调控survivin的表达；生物信息学网站预钡survivin可能是miR-335的靶基因之一。miR-34a与miR-335两者可能具有共同的靶基因survivin。Survivin基因是非常重要而且知名的癌基因,在胃癌中的高表达也与胃癌的侵袭、转移、临床病理分期及预后密切相关。故选取miR-34a与miR-335为本次研究的目标miRNA分子。结果显示两者在胃癌组织中表达均下调；2.利用三个常用的在线生物信息学软件TargetScan、PicTar、miRBase预测miR-335可能的靶基因,结合文献报道与前期实验结果,确定survivin作为潜在的靶基因进行进一步的研究。软件预测miR-335与survivin mRNA 3’UTR存在可能的结合位点。为了验证该结合位点：我们采用双荧光素酶报告基因实验。在HEK293T细胞株中共转染miR-335 mimic或negative control与包含有预测结合位点的野生型基因序列片段的质粒24h后,观察到相对于阴性对照组,荧光素酶活性明显下降,而共转染包含有突变型基因序列片段的质粒荧光素酶活性未见下降。说明survivin基因的3’UTR端存在能与miR-335结合的特异性位点,即miR-335可以直接结合于survivin基因的3’UTR。在胃癌细胞株SGC-7901中重复该实验得到同样的结果,进一步证实了survivin mRNA 3’UTR存在能与miR-335特异结合的位点；3.在正常胃粘膜上皮细胞株GES-1,及四种胃癌细胞株AGS, BGC-823,MGC-803在SGC-7901细胞株中,qRT-PCR方法检测miR-34a、miR-335的表达水平。结果显示miR-34a及miR-335在正常胃上皮组织中表达水平较四种胃癌细胞株中的表达水平为高。在四种胃癌细胞株中,miR-335在MGC-803中表达水平最低,在AGS中表达水平最高；miR-34a在SGC-7901中表达水平最低,在AGS中表达水平最高。由于后续的功能研究设涉及到目标miRNA的过表达或基因敲减,我们选择了两种目标miRNA相对高表达的AGS及相对低表达的SGC-7901两种胃癌细胞株进行后续的研究。通过脂质体瞬时转染miR-34a/335 mimics的方式过表达miR-34a,miR-335后；qRT-PCR方法检测到survivin mRNA表达水平相对于阴性对照组明显下降,western blot法检测到：survivin蛋白表达水平的下降。在AGS细胞株中,目标miRNA敲减后,qRT-PCR方法检测survivin mRNA表达水平升高,western blot法检测survivin蛋白表达水平上升。qRT-PCR及western blot法分别于mRNA及蛋白水平证实miR-34a、miR-335可以负向调控survivin基因的表达；4.在胃癌细胞株SGC-7901中,通过脂质体瞬时转染miR-34a/335 mimics的方式过表达miR-34a或miR-335后,CCK-8实验观察到胃癌细胞增殖能力的下降；流体细胞术观察到发生凋亡细胞数目的上升;Transwell实验观察到相对于阴性对照组,实验组发生侵袭的细胞数目下降(P<0.05,差异有统计学意义)。说明miR-34a、miR-335在胃癌中的生物学效应表现为抑制胃癌细胞增殖、侵袭,促进凋亡,功能上属于抑癌基因。同时过表达miR-34a或miR-335与经过基因修饰的不表达3’UTR的(survivin pcDNA3.1-survivin)后,上述生物学效应大部消失。证实miR-34a、miR-335在胃癌中的生物学效应至少部分是通过调控其靶基因survivin的表达来实现的；5.纳入研究的胃癌病人中,根据其miR-34a、miR-335表达水平中位值,分为相对高表达组及相对低表达组。分析两组病人间临床病理特征差异,结果发现两组病人在性别,年龄,肿瘤位置,组织学类型方面无统计学差异。而在病理分期、局部淋巴结转移两组间差异有统计学意义。miR-34a或miR-335相对低表达组,其临床病理分期中Ⅲ、Ⅳ期占比较高,淋巴结转移发生率高(P<0.05)。病人术后常规随访至术后60个月,绘制Kaplan-Meier生存曲线,结果显示miR-34a、miR-335表达水平低者,病人术后总体生存率低,其预后较差,log-rank检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.miRNA芯片结果显示胃癌组织中miRNA分子的表达异常(相对于癌旁正常组织)普遍存在；2.双荧光素酶报告基因实验证实miR-335可以直接结合于survivin基因的3’UTR;3.miR-335直接,miR-34a间接,两者可共同作用于其靶基因survivin,负向调控其表达,进而在胃癌细胞中发挥其生物学效应,即抑制胃癌细胞增殖,侵袭,促进凋亡；4.胃癌病人标本组织中,miR-34a或miR-335表达水平低者,其临床分期晚,淋巴结转移率高,总体生存率低,提示预后不良。