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锌指转录因子KLF4主要参与细胞增殖、分化、凋亡和自我更新在内的多种生理过程,在个体发育、应答细胞内外压力和多种疾病的病理过程中决定着细胞的命运。因此KLF4的调控机制就显得尤为重要。作为一个与细胞周期和分化密切相关的基因,KLF4在转录、转录后和翻译后水平都受到精密的调节。泛素化修饰是KLF4的翻译后修饰十分重要的一个方面,KLF4的蛋白量在细胞内受到泛素-蛋白酶体途径的严密控制,然而影响KLF4泛素化的机制目前仍未十分明确。我们的工作即着眼于参与KLF4泛素化调节的E3连接酶系统。首先我们购买了E3泛素连接酶siRNA文库,该文库主要包括F-box家族、SOCS-box家族和Cullin家族等约200个基因的特异性siRNA。利用该文库,我们在乳腺癌细胞中进行了针对E3泛素连接酶相关基因的siRNA敲降,以Western blotting方法筛选敲降后会影响KLF4蛋白水平的E3连接酶。通过筛选文库我们首先发现了17个敲降后导致KLF4蛋白水平上升的基因作为候选E3连接酶,然后我们从cDNA中通过PCR扩增得到了五个候选E3连接酶基因,接着我们利用放线菌酮追踪实验发现FBXO32可以显著促进外源KLF4蛋白的降解。于是我们选择了FBXO32作为研究对象进行了进一步的研究工作,证明了FBXO32可以特异性泛素化KLF4并促进KLF4通过泛素-蛋白酶体途径降解。我们又对FBXO32泛素化KLF4的具体机制进行了研究,发现FBXO32的羧基端能够与KLF4的氨基端直接结合,并泛素化修饰KLF4的羧基末端,并且F-box结构域是FBXO32促进KLF4泛素化降解的关键结构域。此外FBXO32介导的KLF4泛素化降解很有可能依赖于p38通路对KLF4的磷酸化。随后,我们对FBXO32泛素化降解KLF4在乳腺癌发生发展中的作用进行了初步的研究和探讨。KLF4在肿瘤发生发展中的作用自该基因被发现以来一直是人们关注的热点。但由于KLF4在细胞生命活动中的广泛参与——比如KLF4在抑制增殖的同时也具有抑制凋亡的特性,又如它在高分化的结肠隐窝上皮细胞中表达,但又具有诱导成年人成纤维细胞恢复干性的能力——使得KLF4在肿瘤中的功能因组织、细胞遗传背景和外界环境而异。由于细胞遗传背景的异质性,KLF4在乳腺癌中的功能更加扑朔迷离,KLF4促进或者抑制乳腺癌的能力对基因表达背景和压力刺激的依赖性更大。我们的工作发现,在正常状态下,FBXO32敲降导致的KLF4蛋白积累抑制了永生化乳腺上皮细胞的迁移能力,但在亚致死剂量DNA损伤的情况下,FBXO32过表达导致的KLF4降低则促进了乳腺癌细胞的凋亡。我们的研究着眼于KLF4的翻译后修饰,发现FBXO32能够直接促进KLF4的多聚泛素化,并以此促进KLF4通过蛋白酶体途径降解。FBXO32介导的KLF4降解调节了乳腺癌细胞的侵袭转移能力和对DNA损伤类化疗药物的敏感性,为进一步阐释乳腺癌发生发展的机制提供了线索。