番茄是世界上种植面积居于第二的农作物,番茄早疫病是番茄上的主要病害,造成全球性的番茄田间和产后巨大的经济损失。番茄早疫病的防治迫在眉睫。目前番茄早疫病的防治手段主要为化学农药,然而农药残留造成环境污染,人畜中毒以及致病菌抗药性增加产生变种等一系列问题。经济、安全、高效的植物源农药恰恰能克服化学农药的缺点,植物源农药具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性、种类多、开发途径多等特点。植物源农药有望成为代替化学农药的新一代药物。本课题研究的目的是寻找代替化学农药的新型植物源农药并探究其抗菌机制,为植物源农药防治早疫病奠定基础。本实验设计与工作包括以下几个方面的内容:1.研究旨在寻找出防治番茄早疫病的经济、安全、高效的植物源药物。此部分测定了 13种植物源药物对番茄早疫病菌的抑制情况,小檗碱对番茄早疫病菌的抑制效果最好,对小檗碱进一步进行毒力测定,其EC50仅为60 μg/mL,MIC为300 μg/mL。在显微镜下观察小檗碱处理前后菌丝形态,发现小檗碱处理后,菌丝表面变形,褶皱。把番茄早疫病菌转接到番茄上进行活体实验,番茄上产生病斑,说明此菌确实对番茄具有致病性。添加小檗碱后,病斑明显变小,且当小檗碱浓度达到300μg/mL时,番茄基本不产生病斑,说明小檗碱确实能有效防治番茄早疫病。2.通过上一部分中的研究,成功从13种植物源药物中筛选到了有效抑制番茄早疫病菌的药物小檗碱,EC50仅为60 μg/mL,MIC为300μg/mL。本章成功筛选到与小檗碱复配的5种植物源药物,分别是藜芦碱、白藜芦醇、厚朴酚、百里酚和黑胡椒水提物。进一步对各物质进行毒力测定,EC50分别为 180μg/mL、322μg/mL、245μg/mL、192μg/mL和0.16 g/mL。两种药物联合使用时可以发挥出比单一药物更高的抑菌功效,这样可以减少剂量,节约成本,本章成功筛选到与小檗碱复配产生协同增效的物质黑胡椒水提物。小檗碱与5种植物源药物复配,结果显示,当小檗碱与黑胡椒水提物复配比为5:1时,产生协同增效作用;小檗碱与黑胡椒水提物复配比为2:3时,产生相加作用;当小檗碱与厚朴酚复配比为1:5、1:2和1:1时产生相加作用,其他复配效果均为拮抗作用。胡椒碱是黑胡椒中的主要抑菌成分,为确定黑胡椒中与小檗碱复配协同增效的成分,本研究对胡椒碱进行了毒力测定,发现其EC50为197μg/mL,与小檗碱进行复配,结果显示胡椒碱与小檗碱复配没有产生协同增效的效果。说明黑胡椒水提物中与小檗碱复配产生增效效应的有效成分不是胡椒碱,其具体成分还有待探究。3.目前对植物源药物的抑菌机制尚不明确,有待深入研究。本小节对小檗碱抑制番茄早疫病菌(Alternaria alternata)的作用机制进行了探究。DARSTS是探究小分子靶蛋白的有效方法,设定不同的酶解时间及不同蛋白酶和蛋白质的比例,SDS-PAGE电泳后都没有靶蛋白,说明小檗碱的抗菌靶点可能不是可溶性蛋白质。通过扫描电子显微镜观察小檗碱作用前后菌丝形态,发现小檗碱处理后,菌丝表面变得褶皱,凹陷,并且当小檗碱浓度为120 μg/mL,发现质壁分离现象,推测小檗碱通过抑制细胞膜来发挥抑菌功效。通过测定小檗碱处理前后电导率的大小,小檗碱处理的菌液电导率较空白对照变大,说明小檗碱造成胞内物质泄漏。测定小檗碱处理前后麦角甾醇的含量,小檗碱处理后的菌体麦角甾醇含量降低,说明小檗碱抑制麦角甾醇合成。上述研究表明小檗碱作用于细胞膜,膜蛋白是A.alternat 细胞膜重要组成部分,在致病性过程中起到非常重要的作用,研究A.alternata膜蛋白有助于寻找抗菌药物靶点,所以本章统计了A.alternata 中95个功能明确的膜蛋白,并对功能进行分类;通过TMHMM server v.2.0在线分析,预测了几个重要膜蛋白的跨膜区信息,包括其跨膜区的数量,疏水性大小,有无信号肽等;并对几种重要膜蛋白在其他植物致病菌中分布情况进行了总结,发现了A.alternata 特异性蛋白以及同源蛋白。