目的:非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素外所导致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征,是一种与胰岛素抵抗、遗传易感性密切相关的代谢应激性肝病。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在生物能量代谢方面扮演着重要角色,AMPK及其下游通路在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病机制中起重要作用。沉默信息调节因子1(Sirtl)本身是一种双向调节蛋白,有研究表明,通过siRNA干扰手段,抑制改善Sirtl与Ampk的表达,可以降低脂肪变性。本研究通过SIRT1/AMPK信号通路探讨SIRT1抑制AMPK对NAFLD的治疗产生积极影响。从正常的生理功能角度,肝脏是一个以代谢和运化功能为主的器官,生理功能包括去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质合成等,这与中医学理论中的脾系统及肝系统生理功能具有联系。因此,从中医角度治疗NAFLD以疏肝健脾,扶正祛瘀,利湿解毒为原则,拟虎金方临床干预。前期研究表明,虎金方可以改善NAFLD模型小鼠肝功能及血脂,并可改善肝组织病理情况和肝细胞超微结构。本实验通过建立NAFLD小鼠及细胞模型,以SIRT1脂质合成通路为切入点,探讨虎金方对体内与体外两种模型的影响机制,为虎金方治疗NAFLD作用靶点提供科学依据。方法:1、C57BL/6雄性小鼠50只,正常组10只,给予维持饲料,40只给予高脂饲料喂养14周建立NAFLD模型;高脂饲料分为模型组、虎金方低剂量组、虎金方中剂量组和虎金方高剂量组。从第15周开始,正常组和模型组小鼠按10ml·kg-1给予0.9%生理盐水灌胃;虎金方各组分别给予高、中、低(21.24,10.62,5.31 g·kg-1)剂量的浓煎药液灌胃,每日一次,一共八周。肝脏组织于-80℃冰箱冻存,用于后续通路检测:RT-PCR法检测Sirt1、Ampk、Srebp-1c、Fas mRNA 的表达;Western blot 法检测 Sirt1、Ampk、Srebp-1 c、Fas 的表达。2、选用HepG2细胞进行研究。通过MTT法确定合适的虎金方浓度,最终设置虎金方高、中、低剂量分别为:160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml。利用油酸及棕榈酸诱导HepG2细胞出现脂质沉积,随后采用虎金方提取物溶液对脂肪变性的肝细胞进行干预,检测药物干预后HepG2细胞内脂滴的减少程度;同时检测培养基上清液ALT、AST、TG、FFAs、TG 的水平。ELISA 法测 SIRT1、SREBP-1C、FAS 做定量分析;Western blot 法检测 SIRT1、AMPK、SREBP-1C、FAS 的表达。结果:1)饲养3周以后,高脂饲料组小鼠较正常组小鼠体重差异明显,模型组增重较快;各组小鼠在第5周开始出现脱毛现象,高脂饲料组脱毛严重,呈斑秃样。经查阅相关文献显示为C57BL/6小鼠基因缺陷所致。第14周,高脂饲料组可见行动迟缓,腹部偏大,食量减少。第15周开始给药后,给药组小鼠体重有下降趋势,但可能由于继续给予高脂饲料,第16周开始,小鼠继续缓慢上升,但是较模型组体重增长速度放缓。第24周解剖小鼠后观察肝湿重,模型组肝湿重较正常组升高,给药组肝湿重均有所下降,高剂量组最接近正常组。2)动物体内水平:虎金方对Sirt1及下游通路因子Ampk、Srebp、Fas的影响:通过对核酸和蛋白表达的观察,模型组较正常组Sirt1表达量下降,虎金方各给药组可提升Sirt1的表达,然后我们通过对比下游基因Ampk、Srebp、Fas表达发现,模型组表达量均有所上升,虎金方各给药组下游基因均有所下降。3)细胞体外水平:ELISA法检测结果表明,模型组SIRT1的表达量较正常组呈下降趋势,虎金方给药组SIRT1表达量与模型组比有所升高;模型组FAS和SREBP的表达量较正常组有上升趋势,虎金方给药组表达量与模型组比有所下降。Western-bloting法检测结果表明,模型组SIRT1蛋白表达比正常组有所降低,虎金方中、高剂量组SIRT1蛋白表达所有上升。模型组AMPK蛋白表达比正常有所升高,虎金方给药组的AMPK蛋白表达比模型组有所下降。模型组FAS和SREBP的蛋白表达与正常组比较没有明显变化,而虎金方高剂量组的FAS和SREBP表达与模型组对比存在一定的下降趋势。结论:从动物体内实验结果表明虎金方可能是通过Sirt1靶点调控下游脂质合成靶点基因,降低脂肪的合成,从而达到治疗脂肪肝的目的。但在细胞体外实验中:FAS与SREBP两靶点的正常组与模型组差异并不明显,说明这两个靶点可能存在被其他靶点基因调控的可能,但高剂量组虎金方与模型组对比,仍旧表现出使两个靶点下降的趋势,这提示我们,虎金方可能通过其他通路因子调节这两个靶点,后续有待进一步研究。