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+Toll样受体(Toll-like receptors ,TLRs)是一类模式识别受体,能够被微生物的特异性成分和某些宿主分子所激活,在固有免疫系统中起着决定性的作用。大量的研究显示, TLRs在哺乳动物的病毒感染应答中发挥重要作用。对鸡TLRs研究的起步较晚,主要集中在对沙门氏菌等细菌感染应答研究方面,而其对病毒感染的应答研究资料甚少,还未见到关于鸡TLRs对新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)感染应答的报道。本实验室在前期研究中发现IL-2信号传导通路中ZEB1和IL-2R基因参与了对NDV感染的应答,但未对其在应答过程中的动态变化进行研究。本试验旨在研究鸡TLR2、TLR 3、TLR 4、TLR 7、ZEB1、IL-2和IL-2R基因对NDV强、弱毒感染转录应答动态规律,为深入研究NDV与机体的相互作用的分子机制提供参考。取得了如下成果:1成功建立了检测鸡TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、转录因子8(ZEB1)、IL-2、IL-2受体(IL-2R) mRNA的荧光定量PCR方法通过自行设计引物,反应条件和反应体系的优化,建立了标准曲线,进行了特异性、灵敏度评价,成功建立了基于SYBR Green I模式检测鸡TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、ZEB1、IL-2、IL-2R等7个基因mRNA的荧光定量PCR方法(RRT-PCR)。结果显示:建立的RRT-PCR方法的扩增效率均在95%~110%,线性范围在102~108之间;熔解曲线分析显示为单特异峰,无非特异性扩增和引物二聚体;最低检测限为1×102。这些RRT-PCR方法的建立,为进一步研究鸡TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、ZEB1、IL-2、IL-2R基因对病毒感染的转录应答提供了精确、可靠的定量方法。2鸡TLR2、TLR3、TLR4、TLR7基因对NDV F48E9、Lasota毒株感染的转录应答用自行建立的RRT-PCR方法检测NDV F48E9、Lasota毒株感染后2、4、8、12、18、24h CEF细胞中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7基因mRNA的动态表达水平,结果显示:NDV强毒株抑制TLR2基因的表达,mRNA的表达水平均低于未感染组,其中2、4h时差异显著。而TLR2基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平除18h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中2h时显著低于未感染组。NDV强毒株抑制TLR3基因的表达,mRNA表达水平除8h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中2、4、18、24h时差异显著。而TLR3基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平在2、4、8、18h高于未感染组,12、24h TLR3低于未感染组。NDV强毒株抑制TLR4基因的表达,mRNA的表达水平除4h时高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中2、18、24h时差异显著。而TLR4基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平除18h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中4、8、24h差异显著。NDV强毒株抑制TLR7基因的表达,mRNA的表达水平除18h时高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中2、4、24h时差异显著。而TLR7基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平除12、18 h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中4、8h时显著低于未感染组。上述结果表明,鸡TLR2、TLR3、TLR4、TLR7基因均参与对NDV的应答反应;但TLR3对NDV强、弱毒感染应答的表达模式截然不同:在感染初期,NDV强毒显著地抑制了TLR3基因的表达,而弱毒显著诱导了TLR3基因的表达。因此推测,TLR3在NDV的感染与免疫中发挥重要作用。这为进一步了解NDV的感染与免疫的分子机制提供了有价值的研究资料。3.鸡ZEB1, IL-2, IL-2R基因对NDV F48E9、Lasota毒株感染的转录应答研究表明NDV强毒可抑制鸡IL-2基因的表达,说明该途径参与了机体对NDV的应答。来自哺乳动物的资料表明,ZEB1和IL-2R这两个作为IL-2基因的上下游基因,参与了IL-2的信号传导,但是关于鸡IL-2R和ZEB1基因在病毒感染过程中发挥怎样的作用还未见报道。本试验用自行建立的RRT-PCR方法检测NDV F48E9、Lasota感染后2、4、8、12、18、24h CEF细胞中ZEB1、IL-2、IL-2R基因mRNA的动态表达水平,结果显示:NDV强毒株抑制ZEB1基因的表达,mRNA表达水平除18h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组,其中2、4、8h时差异显著。而ZEB1基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平在2、12、18h高于未感染组,4、8、24 h低于未感染组。NDV强毒株抑制IL-2基因的表达,mRNA表达水平除18h时显著高于未感染组外,其余时间点均低于未感染组。IL-2基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平在12、18h高于未感染组,2、4、8、24h低于未感染组。NDV强毒株抑制IL-2R基因的表达,mRNA的表达水平均低于未感染组。IL-2R基因对NDV弱毒株的应答表现为波动性变化,mRNA表达水平在2、8、18h时高于未感染组,在4、12、24 h时低于未感染组。上述结果表明,鸡ZEB1、IL-2、IL-2R基因均参与对NDV的应答反应,但对NDV强、弱毒株的转录应答模式存在明显差异,为深入了解NDV感染与免疫的分子机制提供了重要参考。