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基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原，其免疫效果常不尽人意，通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果。 霍乱肠毒素B亚单位（CTB）一直是效果较为公认的粘膜免疫佐剂，但近年文献报道重组CTB与抗原混合后诱导S-IgA产生的能力弱或无，但诱导血清IgG作用较强。CTB的佐剂活性主要依赖其与细胞表面神经节苷酯（GM1）结合的活性。由于CTB主要通过激活Th2途径发挥其佐剂活性，但Th2途径可产生IL-4，IL-4能选择性地促进IgE合成，因而认为CTB可引起变态反应。 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）是近年报道较多的粘膜免疫佐剂，因其肠毒性而在实际应用中受到限制。LT分子结构与CT类似，一个A亚单位和五个相同的B亚单位组成。A亚单位具有ADP-核糖转移酶活性，是毒素的毒性部位。B亚单位能与哺乳动物细胞表面神经节苷脂GM1结合，介导A亚单位进入靶细胞。不少研究结果证实，将LT第63位丝氨酸突变为赖氨酸的突变体（LTK63）的毒性几乎完全消失，但其免疫佐剂活性不变。很多文献报道，单一使用LTKA63或LTB也具有粘膜免疫佐剂活性。LTB的佐剂作用也依赖其与细胞表面神经节苷酯（GM1）结合的活性，LTKA63的作用机制尚不清楚，但大部分研究者认为与其ADP-核糖转移酶活性无关。LT主要激活Th1途径，其次是Th2途径，故认为LT一般不引起 浙江大学硕士学位论文 中艾方要变态反应。令人感兴趣的是，LTKA63和LTB佐剂活性的作用机制不同，两者合用可能有协同效应。 综上所述，LTK63、LTKA63或LTB较之CTB更适合作为D服基因工程疫苗的佐剂。 实验 方法1．菌株来源及培养 大肠杆菌4485株（ECOli 44815）购自中国药品生物制品检定所。将大肠杆菌44815株接种于LB琼脂平板上，37oC培养24 h。挑取单个菌落进行革兰染色镜检，若是革兰阴性、中等大小杆菌者，再次转种培养。加热灭活的霍乱弧菌乐74株培养物由浙江省医学科学院何浙生研究员提供。2．细菌基因组DNA的制备 采用常规的苯酚一氯仿法提取大肠秆菌 4481株与霍乱弧菌东 74株培养物的基因组DNA，经无DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE缓冲液中作为PCR的模板，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。3．PCR 根据报道的 LTA、LTB和 CTB基因序列设计引物，采用 PCR扩增 LTA、LTB和 CTB基因，浚乙锭预染色的1．5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 LTA 基因扩增的引物序列：上游 了CCG GAT ATC ATG AAA AAT ATA ACTTTC－3’（ECORV），厂游 5’－CCG CMM TAT TCA TAA TTC ATC CCG－3’（Xhol）。反应体积100 ql，内含 25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI，、3．0 U EX Taq酶、100 ng DNA模板和IXP＊R缓冲液（pH8．8）。P＊R反应参数为：94℃sffi川XI cy。ie；94℃305，50℃305，72℃60 S，x10。wies：94℃祁S，5丁C30S，72℃70 S（以后每循环增加105），X20＊吓1＊S：720C10min，XI cycle。预期的LTA基因目的扩增片段人小为777hp。 LTB＄1lXllEJ791：x胁上游 5’－CCG pG AAT AAA GTA AAA TA－3’（ECOIU），卜游5’－CCG CTMGAG CTA GT T TTC CAT ACT GA－3’（Xhol）。反应体积100 HI，内含25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI。、30 U EX Taq酶、100 ng DNA模板和 1XPCR缓冲液（pH88）。PCR反应参数为：94’C5min，XI Cycle；94”C30S，50’C305，72 ～2～一’C45S，X10cycles；94’C305，50’C305，72’C505（以后每浙增加SS），X20cycles；72C10min，XI cycle。预期的 Lh基因目的扩增片段人小为 375 hP。 CTBgnch上游了－CCGAfATGATTAAATTAAAAThTG－3’（ECOR！），下游5’－CCG pATATC T TATA ATATT T口C C人TAC、3’（xho！）。反应体积10O山，除引物和模板不同外，所有参与反应的成分、浓度及反应参数与Lh扭珊飞纤酮。预期的Ci基冈日的扩增片段大小为 375 hp。4T七克隆和核旮酸序列测定 采用上海申能博彩生物科技有限公司（SNBC）的 3S PCR Product Purification Kit VZ刀回收目的扩增片段。目的扩增片段连接于pUCm＊载体中，形成用于测序的pUCm－TLTA、pUCm－TLTB和pUCm－TCTB重组质粒。经兰白筛选的阳性克隆扩增后用碱变性法提取重组质粒，酶切鉴定后用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核昔酸序列。所获得的序列与GeneBank登录的大肠杆菌LTA、LTB和霍乱弧菌CTB序列进行核昔酸和氨基酸同源性比较。5．LTA基因点突变 LTA基因点突变为LTKA63的工作委托SNBC完成。6．原核表达系统的构建 LTKA63原核表达载体的构建：采用EcoRV和Xhol ／X酶切pUCm－TLTKA63和表达质粒 pET32a，目的片段经回收后连接。LTB和 CTB原核表达载体的构建：EcoRI和 Xhol双酶切pUCm－TLTB、pUCm－TCTB和表达质粒pET32a，目的片段经回收后连接。将获得的表达载体pET32aLTKA63、pET32a－LTB和pET32a－CTB转化于Ecoll BLZDE3表达宿主菌中，?