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冬瓜(Benincasa hispida(Thaunb.)Cogn.)原产我国南部和印度,目前在我国南北各地均有栽培,是夏秋季的主要蔬菜之一,对调节蔬菜淡季、保证周年供应起着非常重要的作用.冬瓜枯萎病是制约冬瓜生产发展的主要病害.
本文对冬瓜枯萎病病原物(Furarium oxysporum(schL.)emend.)、抗性鉴定以及抗性分子标记进行了比较系统的研究.结合自身的育种优势,对现有种质资源、回交世代尝试开展了分子标记辅助育种研究,并取得初步成效.获得的主要结果如下:
1.从冬瓜、节瓜主产区收集具有枯萎病典型病症的新鲜病样,纯化分离,选择致病力强的菌株,通过对冬瓜、节瓜两类枯萎病菌的形态特征、致病力、寄主范围等研究,结果表明:(1)两类病菌的致病力不同,主要表现在两类病菌对节瓜、冬瓜的致病力有显著差异；两类病菌的毒素粗提液对节瓜、冬瓜的致病力不同；(2)寄主范围不同,两类病菌对西瓜、黄瓜、冬瓜、丝瓜的侵染情况有较大差异.根据专化型与生理小种的定义,本研究认为冬瓜枯萎病菌与节瓜枯萎病菌是冬瓜专化型的不同小种,分别命名为1号小种和2号小种.
2.为了进一步提高冬瓜枯萎病抗性鉴定的效率,本研究开展了不同接种体(病菌、病菌毒素粗滤液(FOB)和化学试剂镰刀菌酸FA)以及接种方法对植株接种效果影响的研究.结果表明:只要浓度适宜,上述3种接种体均可以有效地区别冬瓜品种对枯萎病的抗性,其中病菌适宜浓度为5×106个孢子·1-1、FOB为2～4倍稀释液、FA浓度为150～250 mg/L；发明了一种新的人工接种方法:断根法,该方法与传统的胚根法、伤根法相比具有简便、快捷、准确和稳定等优点.同时对毒素粗提液的培养方法进行了改良,认为连续光照、接种浓度为5×105个孢子·ml-1、振荡速度为120 rpm、培养时间20 d的条件下为最适宜.
3.针对冬瓜种质资源遗传狭窄的现状,开展了冬瓜种质资源创新工作.利用花粉管导入法,将携带了枯萎病抗性基因的黑籽南瓜的DNA导入优质冬瓜材料,以注射剂量、pH、注入时间、注入方法为因素,正交设计方案筛选出适宜冬瓜的方案.结果表明:以子房注射法,授粉后24 h导入pH为7.5、浓度为1.2 mg·ml-1 DNA溶液的处理,对冬瓜坐果率影响最小.导入外源DNA的植株,经自交多代定向选择,获得了两份抗性强、品质优良的新种质材料B28-1.2-4-3.1和G21-1.2.1.2-1,其中G21-1.2-1-2-1已运用于育种实践.
4.根据经典遗传学原理,利用完全双列杂交方案,选择了6个不同抗性水平的冬瓜材料开展了枯萎病抗性遗传规律研究.结果表明:冬瓜枯萎病抗性是由隐性多基因控制,符合"加性-显性"模型,以加性效应为主,感病对抗病表现为部分显性,显性基因比例较高,且表现减效；狭义遗传力为60.46％；加性基因为3对；显性座位数为1对.这些结果表明,在冬瓜抗枯萎病遗传育种过程中,早期世代选择不宜太严.
5.针对冬瓜叶片含有较多的多糖等次生代谢物质,本研究进行了冬瓜DNA提取方法的筛选.认为PVP、CTAB-free法比较适宜提取高质量的冬瓜DNA；以Mg2+浓度、Taq浓度、引物浓度、模板浓度以及PCR循环数为因素,采用正交设计法,优化了冬瓜枯萎病抗性RAMP(Random Amplified Microsatellite Polymorphism)反应条件,筛选出最佳RAMP反应体系:反应总体积25μl,包括10×PCR缓冲液2.5μl,25 mmol·1-1 MgCl2 2.0μl,2.5 mmol·1-1dNTP 0.5μl,Taq DNA聚合酶1U,引物2 μl,模板DNA 1.5μl,加ddH2O至25μL.扩增反应的热循环条件为:94℃ 5min预变性,94℃ 1 min,61℃30s,72℃1 min(35循环),72℃延伸10 min.从52个18碱基随机引物中找到1个引物CGA-6(ATFCGACGACGACGACGA)能在抗性基因池中产生一条分子量约为380 bp的特异性扩增条带,命名为CGA-6380.该条带与抗性基因的遗传距离为5.2 cM.
6.初步建立了冬瓜枯萎病抗性分子辅助育种体系(Marker-Assisted Selection,MAS).利用抗性标记CGA-6380对42份冬瓜种质资源和17个杂交组合进行了分子标记辅助选择研究,同时利用病菌、病菌毒素粗滤液进行人工接种抗性鉴定.初步结果表明,凡含有CGA-6380特异带的冬瓜材料在人工接种鉴定试验中都表现为抗病,但也有部分抗病材料却没有CGA-6380特异带.这表明有CGA-6380条带的材料一定有抗性,而没有CGA-6380条带的材料未必没有抗性.CGA-6380适宜筛选携带有B94抗性基因的材料.利用此标记在回交选育、杂种优势预测等方面进行了有益的尝试.结果表明,MAS在种质资源抗性鉴定、回交选育、杂种优势预测等方面与常规育种方法有机结合,将可以大大提高工作效率和育种进程.