【摘 要】
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多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida Toxin,PMT）是多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）产生的重要毒力因子。介导PMT细胞毒性的宿主因子及其机制尚不清,本研究旨在探究宿主细胞趋化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8）介导重组多杀性巴氏杆菌毒素（Recombinant Pasteurella
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多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida Toxin,PMT）是多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）产生的重要毒力因子。介导PMT细胞毒性的宿主因子及其机制尚不清,本研究旨在探究宿主细胞趋化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8）介导重组多杀性巴氏杆菌毒素（Recombinant Pasteurella multocida Toxin,r PMT）的细胞毒性作用及机理。一、成功构建r PMT对猪肾细胞（Porcine kidney-15 cell lines,PK15）的细胞毒性模型。分别以0μg/m L、10μg/m L和30μg/m L的r PMT刺激PK15细胞36 h,接毒后细胞会变圆漂浮、轮廓模糊且间隙扩大,CCK-8法测定细胞存活率分别可达到108.31%、25.11%和10.39%左右,LDH总释放率分别可达到0.41%、19.85%和21.41%左右,且实验组与正常对照组相比细胞存活率和LDH总释放率均达到极显著差异（P＜0.0001）。二、发现并鉴定宿主因子CXCL8介导了r PMT对PK15的细胞毒性作用。依据构建的细胞毒性模型分别以0μg/m L和30μg/m L的r PMT刺激PK15细胞36 h后,转录组分析发现CXCL8是介导r PMT细胞毒性的关键宿主因子之一,随后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了PK15ΔCXCL8细胞系,以0μg/m L、10μg/m L和30μg/m L的r PMT刺激PK15ΔCXCL8细胞36 h后发现细胞极少变圆、间隙无明显扩大、轮廓较为清晰但发生一定形变,CCK-8法测定细胞存活率分别为102.67%、127.95%和62.87%,LDH总释放率分别为0.34%、13.23%和17.12%,PK15ΔCXCL8细胞与PK15细胞相比具有明显的抵抗力,证实CXCL8介导了r PMT对PK15细胞的毒性作用。三、揭示了宿主因子CXCL8主要通过凋亡途径介导r PMT的细胞毒性。第1,cxcl8基因敲除后染毒,AO-EB染色显示凋亡细胞比例降低（P＜0.001）,WB检测显示Caspase3等凋亡信号蛋白切割被抑制,细胞凋亡被下调;第2,Calcein/PI染色及mlkl转录水平检测显示细胞坏死被上调,焦亡与自噬等途径相关的il1b、lc3b等转录水平有一定程度下调。表明宿主因子CXCL8主要通过凋亡途径介导r PMT的细胞毒性。
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