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重组免疫毒素是一类重要的肿瘤靶向性治疗药物。由具有细胞选择性作用的导向分子和细菌或植物毒素组成,它能特异性杀伤靶细胞,而不损伤正常组织细胞,可用于肿瘤、组织器官移植、自身免疫性疾病、HIV感染等免疫相关疾病。尽管重组免疫毒素具有广阔的应用前景,但是在临床应用中仍面临许多挑战,如免疫原性强和穿透性差,解决方法之一就是构建小分子人源化的重组免疫毒素。Bid(BH3 -interacting death agonist)是Bcl-2家族BH3亚家族的一个成员,具有促凋亡活性。Bid蛋白只含BH3结构域,全长为195 aa,分子量22 KDa。Bid位于细胞浆,当其被活化的Caspase-8或其他蛋白酶切割后,去除N末端片段,产生的截短体片断(truncated Bid, tBid;15 kDa)从细胞浆转位到线粒体,主要通过控制细胞色素c(Cyt c)和其它促凋亡分子的释放来促进细胞凋亡。HER2是癌基因erbB2/neu的表达产物,能传导生长信号而导致细胞的恶性增殖。HER2是目前公认的肿瘤细胞表面特异性标志分子,在乳腺癌等多种肿瘤细胞中高度表达,是一种理想的治疗靶点。因此,以抗HER2单链抗体为导向分子,以人活性促凋亡分子tBid为毒性部分构建的重组免疫促凋亡分子是一种潜在的免疫原性低、穿透力强的抗肿瘤药物。本研究中构建的重组免疫促凋亡分子由抗HER2单链抗体e23sFv和活性促凋亡分子tBid构成,白喉毒素转位结构域中含有Furin酶切位点的十肽(187 aa-196 aa)插入其间,连接导向分子和毒素分子。将重组基因克隆入原核表达载体pQE30,转化宿主菌,IPTG诱导表达,目的蛋白以包涵体形式存在。经亲和层析纯化、透析复性后,获得e23sFv-TD-tBID融合蛋白。进一步研究其生物学活性。细胞ELISA、流式细胞术和间接免疫荧光结果显示,e23sFv-TD-tBID能特异地结合并内化入HER2阳性肿瘤细胞,对HER2阴性的细胞无此作用。MTT结果显示,e23sFv-TD-tBID能明显抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长,对HER2高表达的SK-BR-3、SKOV-3细胞杀伤作用最强,这说明e23sFv-TD-tBID对靶细胞的杀伤作用和细胞表面HER2分子表达量密切相关。e23sFv-TD-tBID通过诱导凋亡来抑制肿瘤细胞生长。此外,我们还从乳腺癌病人的胸水中分离培养原代乳腺癌细胞,发现e23sFv-TD-tBID也可以结合并杀伤HER2阳性的原代乳腺癌细胞。动物实验结果显示,单独使用e23sFv-TD-tBID治疗可以抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,这种抑制作用具有剂量依赖性,在治疗期间未见明显的毒副作用。当e23sFv-TD-tBID与化疗药物联合使用时,抑瘤作用更加显著。综上所述,本研究构建了重组免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID,经原核表达、纯化、复性,获得e23sFv-TD-tBID融合蛋白。体外细胞学实验表明,e23sFv-TD-tBID能特异性结合并内化入HER2阳性肿瘤细胞诱导其凋亡,体内抑瘤实验表明,e23sFv-TD-tBID具有一定的抗肿瘤活性,与化疗药物联合使用作用更加显著,为进一步探讨其作为抗肿瘤药物的临床应用奠定了基础。