基因组计划的完成为生命科学研究提供了广阔的平台，具有里程碑式的意义。但是，生命的复杂性和多样性表明，仅对遗传信息载体—基因组进行研究，还远不能对生命活动的机理做出全面的解释。基因的表达调控是多层次的，作为基因的最终产物—蛋白质才是执行功能的单元体。因此，要对复杂的生命活动有全面的认识，必然要在蛋白质水平上对生物体进行深入的研究。家蚕基因组完成以后，家蚕的研究进入了功能基因组研究时代，而家蚕蛋白质组学作为后基因组研究的重要内容之一，也逐渐成为了人们研究的热点。本研究在建立了高质量的蛋白质组学研究平台的同时，还对家蚕丝腺、血液、脂肪体等组织在不同发育组织时期的蛋白质构成进行了调查研究，主要获得了如下结果：一、家蚕高质量蛋白质组学研究平台的建立本实验采用不同的方法对家蚕各组织进行双向电泳研究，从样品处理方案、等电聚焦时间、不同类型设备的聚焦效果、不同染色方法的差异、实验中常见的问题等因素对家蚕双向电泳研究体系进行了全面的分析和优化。结果发现，对于家蚕丝腺等样品组织，采用加液氮研磨、高速离心的方法比采用TCA沉淀的方法更为合适，蛋白损失少，图谱均匀清晰。因此，本实验经过各种条件优化建立了一套适合于家蚕组织样品分析的双向电泳研究方法，与前人的电泳研究结果相比较，利用这种方法所获得的双向电泳图谱中蛋白点的分辨率和重复性更高。在建立家蚕蛋白点肽质量指纹图谱分析体系时，本实验对胶内消化过程中的胰酶用量，挖点大小、基质辅助激光解吸飞行时间质谱的参数选择等实验条件进行了分析总结，构建了高质量、高通量的家蚕凝胶挖点和质谱分析研究平台。结合家蚕基因组数据，采用GPMAW软件建立了本地家蚕肽质量指纹图谱检索分析系统。与传统的MASCOT在线检索方法相比，该方法不仅可以快速方便的对NCBI已报道的家蚕蛋白质进行鉴定，而且可以对未曾报道过的，但已被家蚕基因组所预测的家蚕蛋白质进行有效的鉴定。二、家蚕丝腺组织蛋白质组学分析在家蚕蛋白质组学研究平台建立以后，首先对与家蚕经济性状最为密切相关的丝腺组织进行了的蛋白质组学分析。采用18cm，pH 3～10胶条和12.5％SDS-PAGE所获得的丝腺双向电泳图谱背景较低，蛋白点的分布均匀，通过图象扫描和软件分析可以明显检测到超过700个蛋白点。在此基础之上，实验对中部丝腺和后部丝腺进行了比较蛋白质组学研究，发现中部丝腺和后部丝腺都可以得到清晰均匀的蛋白质双向电泳图谱，且两张图谱的蛋白点存在着极为相似的分布模式，其中中部丝腺可检测到的蛋白点有612±12个，在后部丝腺可检测到的蛋白点有598±28个，匹配率达到了80％以上。针对中部丝腺和后部丝腺一些较为明显的差异蛋白点，实验采用MALDI-TOF MS型质谱设备对其进行了鉴定，结果发现这些差异蛋白中包括了一些热激蛋白、DNA转录相关因子及一些新发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂等。为了进一步确认肽质量指纹图谱的鉴定结果，实验又利用MALDI-TOF PSD的方法对两个新发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了源后裂解分析，结果发现母离子肽段所产生的二级碎片离子几乎可以被所预测的肽段序列完整的解析，从而证明了数据库鉴定结果的准确性。通过对其结构和表达模式的调查分析，推测丝腺中这两个高表达丝氨酸蛋白酶抑制剂可能与抑制丝蛋白的降解机制相关。在对家蚕后部丝腺中98个较明显蛋白点进行质谱鉴定和数据库检索分析时，发现95％以上的蛋白点的肽质量指纹图谱都有较好的信噪比和质量精度，而其中的88个蛋白点得到了成功鉴定，成功率接近90％。它们涉及分子伴侣蛋白、结构蛋白、氧化还原蛋白、蛋白酶抑制剂及与代谢相关的酶类等，这对人们认识丝腺的生理活动提供了有效的参考。将本次实验结果与前人的实验结果相比，发现丝蛋白的重要组分丝素轻链和p25蛋白在不同实验结果中的差异很大。经过对所采用材料的品种、时期和实验方法等差异因素分析之后，推测Fib-L、p25在不同实验中所得到的差异现象可能与实验所采用不同的品种有关系。三、家蚕血液蛋白质组研究家蚕在发育变态过程中血液蛋白组成变化极为明显。本实验首先对不同发育时期的家蚕血液蛋白质进行了SDS-PAGE电泳分析，从整体上对5龄幼虫到羽化当天的家蚕血液蛋白质变化趋势进行调查。在此基础上，实验利用双向电泳技术对家蚕5龄幼虫第3天、5龄幼虫第6天、化蛹第3天、化蛹第8天、羽化当天雄蚕和雌蚕血液进行了分析研究，结果发现，一些蛋白质在生长和变态发育过程中发生明显上调表达或下调表达现象。采用质谱技术对这些发育时期差异蛋白点鉴定时，发现它们不仅包括了SP贮存蛋白、30K蛋白、Vn(卵黄原蛋白)等已被研究报道的蛋白质，还包含了一些未曾被发现的新蛋白质，如Aldose reductase homolog，Apolipoprotein D homolog等，它们可能参与了如食物消化、物质代谢、羽化飞行等不同发育阶段的重要生理活动；在对家蚕血液蛋白重要成分30 K蛋白进行鉴定时，发现利用双向电泳和质谱鉴定的方法可以从家蚕化蛹第3天的血液中鉴定出5种不同的家蚕30K家族成员，由于其表达量高，等电点、分子量接近的特点，在双向电泳图谱中发生了蛋白的融合现象；在对家蚕5龄第3天血液蛋白点进行鉴定时，实验成功获得了47个蛋白点的鉴定结果，这其中包括大量与物质代谢相关的酶类、离子转运蛋白、蛋白酶抑制剂类、免疫相关蛋白质等，它们对血液执行物质运输和其他相关功能具有极为重要的意义；在比较家蚕受到不同微生物侵染后血液蛋白组成变化情况时，实验发现一些蛋白表达量发生了上调或下调反应，其中最为明显的是家蚕血液蛋白30K、Transferrin、ApolipophorinⅢ等蛋白质，它们虽然不是昆虫的免疫信号传导途径中主要蛋白，但是此现象暗示了这些蛋白极有可能与家蚕的免疫反应体系相关。四、家蚕脂肪体组织蛋白质组学研究本实验首次利用蛋白质组技术对家蚕5龄第5天的脂肪体组织进行研究，结果发现，从pH3～10，18cm胶条，12.5％的SDS-PAGE的双向电泳图谱中可以清晰的得到近700个蛋白点，图谱的背景低，蛋白点分离效果良好。利用MALDI-TOF MS对家蚕脂肪体双向电泳图谱中表达量较高的41个蛋白点进行凝胶挖取和质谱分析时发现，其中80％以上的蛋白点都得到了良好的鉴定结果。它们当中含有大量与代谢反应相关的酶类物质，与免疫反应相关的蛋白、家蚕血液蛋白重要的成分30K蛋白、核糖体蛋白、细胞骨架蛋白、热激蛋白等，这些蛋白的鉴定为人们从蛋白质水平上认识家蚕脂肪体提供了有力的帮助；本实验采用比较蛋白质组学的方法对家蚕化蛹变态期脂肪体组织进行了研究，结果发现，上簇第2天的家蚕脂肪体和化蛹后第2天的脂肪体蛋白质组成发生了明显的变化，利用MAIDI-TOF MS对其中一些较为明显的蛋白点进行鉴定时，发现这其中包括了家蚕血液30K蛋白、细胞骨架蛋白actin、tubulin、热激蛋白等蛋白质；为了更加方便准确的对差异蛋白进行分析，实验还采用DIGE技术对家蚕化蛹前后的脂肪体蛋白质组成变化进行了研究分析，结果表明，在化蛹前后的短暂时间内，脂肪体的一些蛋白质表达发生了明显的上调或下调反应。这些化蛹前后蛋白质的变化为人们认识昆虫变态机理提供了重要的参考。五、家蚕中肠、精巢、胚胎等组织蛋白质组学研究初探除了对家蚕的丝腺、血液、脂肪体进行了蛋白质组学研究以外，本实验还对家蚕中肠、精巢、胚胎等组织进行了一些蛋白质组学的初步研究，这为以后的家蚕蛋白质组研究工作打下了良好的基础。在利用18cm，pH3～10胶条，12.5％的SDS-PAGE对家蚕中肠组织进行双向电泳分析时发现，经过硝酸银染色，可以从中肠双向电泳图谱中检测到超过600个较为明显的蛋白点，在成功鉴定的36个蛋白点中，涉及到与肌肉运动相关的蛋白，如tropomyosin；与糖和脂肪代谢相关的蛋白，如Enolase，triosephosphate isomerase，Transketolase；离子转运蛋白，如vacuolar ATP synthase、H+-transporting ATPase、Porin；细胞凋亡因子，如SMP-30，Nucleoside diphosphate kinase等，这有利于人们进一步认识中肠的功能；在利用pH3～10，13cm胶条12.5％SDS-PAGE对家蚕精巢组织做调查分析时，发现在精巢组织的双向电泳图谱中可以明显检测到超过350个蛋白点，它们主要分布在pH4～9，分子量20kD～80kD之间，良好图谱的建立为今后对精巢的进一步研究奠定了基础；本实验还对不同发育时期的卵蛋白质组成变化进行了初步分析，并对其中一部分较为明显的差异蛋白带进行了质谱鉴定，除了卵特异蛋白ESP，卵黄磷蛋白这些在胚胎变化过程中重要的蛋白以外，实验还鉴定出了actin 3肌动蛋白，它在家蚕胚胎发育后期有明显上调表达的趋势，这为今后进一步分析不同时期的卵蛋白质组成变化提供了宝贵的参考。目前，虽然家蚕蛋白质组学的研究工作逐渐受到了人们的重视，但在国内外都还处于起步阶段，本实验在建立了高通量、较为完整的家蚕蛋白质组学研究平台的同时，对家蚕丝腺、血液、脂肪体等组织进行了较为深入的蛋白质组学研究，为今后开展大规模的家蚕蛋白质组学研究工作奠定了良好的基础。