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研究目的基于中国食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）高发区人群,描述正常不吸烟不饮酒人群,以及正常吸烟饮酒人群口腔、食管上中下三段菌群的构成,探索吸烟饮酒对正常人口腔、食管上中下三段菌群构成的影响。同时收集正常人、食管低级别异型增生、高级别异型增生、食管鳞癌人群口腔、食管配对样本,对比各组人群口腔、食管菌群构成差异,筛选出各组差异性菌群,探索微生态变化与食管鳞癌及其癌前病变的关联,为食管鳞癌的病因学探索、食管癌早期筛查、早期诊断及治疗,提供微生物组学方向的证据。材料与方法1、吸烟和饮酒对健康人口腔和食管微生物群的影响:以山东省肥城市食管癌高发现场参加上消化道癌筛查项目的76例正常人群的唾液和食管上中下段细胞刷样本为研究对象,基于Ion S5TMXL平台,运用16S核糖体RNA（16S rRNA）测序技术和 QIIME2（Quantitative Insights into Microbial Ecology）软件对标本进行测序和生物学分析,对比正常不吸烟不饮酒人群和正常吸烟饮酒人群唾液、食管上、中、下段微生物构成的差异。运用线性判别效应量分析（Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe）寻找各个部位的特异菌。2、食管癌前病变和鳞状细胞癌患者口腔和食管微生物群的特征:收集中国医学科学院肿瘤医院、河南省林州市肿瘤医院、河北省磁县肿瘤医院和山东省肥城市人民医院,食管正常、低级别异型增生、高级别异型增生、食管鳞癌共计276例病人的唾液、食管细胞刷配对样本,基于Ion S5TMXL平台,运用16S rRNA测序技术和QIIME2软件对比食管癌不同病理分期各组唾液、食管细胞刷样本微生物构成的差异,运用LEfSe和随机森林筛选出各组特异微生物（属水平）,并使用随机森林建模评估疾病组特异菌的诊断效力。利用PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States,通过重建未观察到的状态对群落进行系统发育研究）进行功能预测。唾液和细胞刷样本中同一病理程度的物种在属水平上的差异采用DESeq2分析。研究结果1、正常不吸烟不饮酒人群唾液中有普雷沃氏菌属（Prevotella）、奈瑟菌（Neisseria）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）等13种特异菌。食管上段标本中,有链球菌属（Streptococcus）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、孪生球菌（Gemella）和丁酸梭菌属（Butyrivibrio）4种特异菌。食管中段标本中,有拟杆菌属（Bacteroides）、约翰森氏菌属（Johnsonella）、食酸菌属（Acidovorax）等6种特异菌。食管下段标本中,有乳杆菌（Lactobacillus）、节旋藻（Arthrospira）、博斯氏菌属（Bosea）等18种特异菌。2、正常吸烟饮酒人群唾液中有普雷沃氏菌属（Prevotella）、奈瑟菌属（Neisseria）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）等15种特异性微生物;食管上段标本中,有链球菌属（Streptococus）一种特异性微生物;在食管中段标本中,有博斯氏菌属（Bosea）、柄杆菌属（Caulobacter）、贪铜菌属（Cupriavidus）等35种特异性微生物;食管下段标本中有嗜血杆菌属（Haemophilus）、孪生球菌（Gemella）两种特异性微生物。3、与不吸烟不饮酒组相比,吸烟饮酒组的唾液样本有普雷沃氏菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porohyromonas）、梭杆菌属（Fusobacterium）等15种特征性微生物;食管上段样本有链球菌属（Streptococcus）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、孪生球菌（Gemella）等14种特征性微生物;食管中段样本有博斯氏菌属（Bosea）、柄杆菌属（Caulobacter）、支原体（Mycoplasma）等32种特征性微生物;食管下段样本有罗氏菌属（Rothia）、链球菌属（Streptococcus）、孪生球菌（Gemella）等15种特征性微生物。4、对于唾液标本,在属水平上,食管鳞癌的特异性微生物为嗜胨菌属（Peptoniphilus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、博斯氏菌属（Bosea）、毛螺菌G9属（Lachnospiraceae[G-9]）、孪生球菌（Gemella）、Solobaterium和链球菌（Streptococcus）。食管高级别异型增生的特异性微生物为芽孢杆菌（Bacillus）、Peptoniphilaceae[G-3]、鲍特氏菌属（Bordetella）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）、细小单胞菌（Parvimonas）、农杆菌（Agrobacterium）、孪生球菌（Gemella）、乳杆菌（Lactobacillus）、颗粒链菌属（Granulicatella）、毛螺菌科 G9 菌属（Lachnospiraceae[G-9]）和链球菌（Streptococcus）。食管低级别异型增生的特异性微生物为肠球菌（Enterococcus）、厌氧菌（Lachnoanaerobaculum）、异氧菌（Atopobium）、细孔菌（Veillonella）、细小单胞菌（Parvimonas）、孪生球菌（Gemella）、Solobaterium、放线菌（Actinomyces）、纤毛菌（Leptotrichia）、单糖菌门 G7菌属(SaccharibacteriaTM7[G-7])、沙利亚氏菌属（Schaalia）、颗粒菌（Granulicatella）、罗氏菌（Rothia）和链球菌（Streptococcus）。其中链球菌（Streptococcus）是经过LEfSe和随机森林筛选出来的,属于低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC病人的共同特异菌。5、对于细胞刷标本,在属水平上,食管鳞癌的特异性微生物为细小单胞菌（Parvimonas）、蜈蚣菌属（Centipeda）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、细孔菌（Veillonella）、单糖菌门 G1 菌属（Saccharibacteria（TM7）[G-1]）、沙利亚氏菌属（Schaalia）、Solobacterium、孪生球菌（Gemella）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、纤毛菌（Leptotrichia）、不动杆菌（Acinetobacter）、AbsconditabacteriaSR1[G-1]、罗氏菌（Rothia）、梭杆菌属（Fusobacterium）和博斯氏菌属（Bosea）。高级别异型增生的特异性微生物为毛螺菌科 G2 菌属（Lachnospiraceae[G-2]）、乳杆菌（Lactobacillus）和博斯氏菌属（Bosea）。低级别异型增生的特异性微生物为沙利亚氏菌属（Schaalia）、纤毛菌（Leptotrichia）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、梭杆菌（Fusobacterium）、颗粒菌（Granulicatella）、孪生球菌（Gemella）、罗氏菌（Rothia）和链球菌（Streptococcus）。其中博斯氏菌属（Bosea）是经过LEfSe和随机森林筛选出来的,属于低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC病人的共同特异菌。6、唾液和细胞刷样本中排名前3菌属用于区分食管低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC患者和正常人的ROC曲线下面积（Area Under the Curve,AUC）分别为 91.16%、80.28%和 87.16%;91.2%、73.97%和 89.13%。7、PICRUSt2结果表明,细胞刷样本中,高级别异型增生、ESCC患者编码亚硝酸还原酶基因丰度显著下降;唾液样品中,高级别异型增生、ESCC组编码亚硝酸还原酶基因丰度显著下降,而且ESCC组编码硝酸盐还原酶基因丰度显著上升（P＜0.05）。研究结论1、吸烟和饮酒会改变口腔及食管上中下段微生态的组成,造成口腔中与牙周病、龋齿、口腔癌相关的菌属（牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、链球菌属（Streptococcus）、普雷沃氏菌属（Prevotella）等）)丰度增加。但吸烟饮酒者食管上中下段的特征微生物,并不是既往研究中发现的巴雷特食管、食管腺癌、ESCC的特异菌。2、正常人、食管低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC病人的唾液和病变表面的微生物菌群构成存在显著差异。链球菌属（Streptococcus）是经过LEfSe和随机森林筛选出来的,属于低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC病人唾液中的共同特异菌;博斯氏菌属（Bosea）则是上述病人食管表面的共同特异菌。3、食管低级别异型增生、高级别异型增生、ESCC病人的唾液和病变表面的微生物特征性菌属,具有良好的区分正常人与病人的诊断效力,可以作为ESCC筛查、早诊早治的临床诊断标志物。功能预测分析显示,ESCC病人口腔产生亚硝酸盐能力增加,同时口腔、食管代谢亚硝酸盐功能均降低。未来针对本研究发现的食管不同疾病状态的特异菌与宿主间相互作用的研究,将有助于未来食管鳞癌的病因学研究、疾病诊断和治疗,以及无创性早期癌症筛查产品的开发。