犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性且高度传染性的传染病。CD的发生率很高,致死率高达50%,严重影响了犬类繁殖和毛皮动物繁殖的发展。因此,本研究收集济南地区疑似感染CD的临床样本,扩增CDV H基因并进行遗传差异分析。同时,用CDV免疫羊驼,构建犬瘟热病毒特异性纳米抗体噬菌体文库,并进行犬瘟热的纳米抗体的筛选和表达。实验1:济南犬瘟热病毒H基因的克隆及遗传进化分析为了调查济南宠物犬瘟热的感染状况,于2019年1月至2019年6月在济南一家宠物医院随机收集了56例怀疑感染CDV的临床拭子样本,通过RT-PCR方法扩增了CDV H基因的全长序列,经测序后分析了H基因序列的遗传变异。结果显示,RT-PCR共检测到7个阳性样品。H基因核苷酸同源性为98.7%-99.9%,氨基酸同源性为98.7%-100%。与疫苗株相比,差异很大。与疫苗株相比,同源性为90.0%-90.9%,氨基酸同源性为88.8%-91.4%。遗传进化表明,这7个菌株均为中国目前所有的亚洲Ⅰ型菌株,与北京毒株(BJ17BC1)及黑龙江毒株(HRB-E8和HLJ-1-14)相似。与广东株(GD1811和GD1810)形成一个大的分散分支。H基因的氨基酸基因分析表明,与参考菌株相比,7个毒株变异程度不同。糖基化位点分析显示,除了SD-07包含8个潜在的天冬酰胺糖基化位点外,其余6个菌株均为9个潜在的天冬酰胺糖基化位点,而这6个菌株均包含野生株。唯一的g3(309)糖基化位点与疫苗株有很大差异,但与亚洲Ⅰ野生株高度一致。H基因抗原的预测分析显示7种野生病毒株与疫苗株有显着差异。研究表明,济南流行的CDV主要是亚洲Ⅰ型。这7个野毒株与疫苗株有很大的遗传差异,并且不同株之间存在遗传多样性。实验2:CDV特异性抗体的噬菌体文库的构建和鉴定为了获得CDV特异性抗体噬菌体文库,首先使用超纯化的CDV,然后使用纯化的CDV免疫羊驼,使用巢式PCR扩增纳米抗体(Nanobodies,Nbs)序列,构建CDV特异性抗体噬菌体文库,然后选择40个单克隆,计算阳性克隆的数量,随机选择13个序列进行序列验证,并计算存储容量并分析文库多样性。结果表明,第四次免疫后,血清抗体滴度可达1:25,000,符合文库建设的要求。巢式PCR扩增了一个400 bp的条带,与预期的Nbs大小一致。噬菌体展示文库的文库容量确定为3.41×109 PFU,阳性率为90%。测序结果表明,选择的13个VHH片段的序列不同,其中互补性决定了3区(CDR3)的最佳多样性。以上结果表明该研究成功构建了CDV特异性抗体噬菌体文库。该文库容量大,多样性丰富,阳性率高,为后续的纳米抗体表达奠定了基础。实验3:犬瘟热特异性纳米抗体的筛选和表达将纯化的CDV包被在ELISA板上,并对CDV特异性抗体噬菌体文库进行三轮淘选以富集特异性结合CDV的噬菌体。选择单克隆,并使用噬菌体-ELISA鉴定和选择具有高结合能力的噬菌体。通过巴斯德毕赤酵母表达系统表达和纯化该基因序列,并通过ELISA和IFA鉴定其结合力。结果表明,经过三轮淘选,总共富集了85个阳性克隆,阳性率为88.5%(85/96);酵母表达系统用于表达两个纳米抗体。WB鉴定结果表明,在15 kDa处有明显的条带。ELISA和IFA鉴定实验中表达的两种纳米抗体均可特异性结合CDV。上述结果表明该研究成功地筛选并表达了两种与CDV特异性结合的纳米抗体菌株。综上,本研究初步分析了济南地区当前CDV流行株的遗传差异,对有针对性的有效CD防治措施具有指导意义。成功构建了CDV特异性抗体噬菌体文库,表达纯化了2株特异性结合CDV的纳米抗体,为后期建立犬瘟热诊断方法和筛选具有中和活性的纳米抗体提供了实验基础。