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白血病(leukaemia)是一种人体造血组织的原发性血液疾病,严重危害人类健康的血液系统。骨髓移植自体造血干/祖细胞移植已成为治疗白血病的最有效途径,有效的体外净化方法是自体移植成功的关键。 光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)作为一种临床治疗癌症的方法,具有靶向性好(仅将光敏剂周围的病变细胞作为目标)以及对病患伤害小的优点,被广泛地应用于肿瘤的治疗。在PDT中,光敏剂吸收特定波长光子能量,并将能量转移给分子氧,生成活性氧杀伤细胞。 本论文对基于5-ALA和纳米TiO2的复合型光敏剂光动力疗法体外灭活白血病肿瘤细胞HL60进行实验研究。首先利用表面修饰的方法制备了5-ALA/TiO2复合纳米粒子,并用傅里叶红外光谱、拉曼光谱、紫外-可见光吸收光谱等对样品进行表征;随后,本文分别利用CCK-8检测法研究了不同浓度的5-ALA、TiO2和5-ALA/TiO2对HL60细胞的体外PDT灭活作用,5-ALA/TiO2对HL60的细胞的暗毒性作用;利用激光显微拉曼光谱研究了细胞内部的纳米TiO2,利用相衬显微镜对5-ALA/TiO2介导的PDT作用过程进行了观测,并结合扫描电镜观测5-ALA/TiO2介导的PDT作用前后的细胞的超微结构的变化,最后根据实验结果对TiO2和5-ALA联合作用分析探讨药物作用细胞的机理。具体研究结果如下: (1)傅里叶红外光谱、激光显微拉曼光谱显示5-ALA与TiO2通过化学键合的方式结合,紫外-可见光谱显示TiO2对可见光的吸收增强,进一步验证5-ALA与TiO2结合紧密,透射电镜表明5-ALA在纳米TiO2表面形成膜。 (2)5-ALA单独作用介导的PDT对HL60细胞有明显的灭活作用,随着5-ALA浓度的增加,其对HL60细胞的灭活效率升高,呈浓度依赖关系。但当5-ALA浓度达到一定程度时,灭活效率没有显著变化。而TiO2单独介导的PDT对HL60细胞的灭活作用较小,浓度越大对细胞生长抑制作用越强。 (3)5-ALA/TiO2复合纳米粒子对HL60细胞PDT实验表明,在浓度0-145.50μg/mL之间,5-ALA/TiO2的PDT效率有所提升,在浓度145.50-291.00μg/mL时,效率提升更快,而在浓度291.00-363.75μg/mL之间,PDT效率无显著变化,出现某种饱和效应。 (4)激光显微拉曼光谱检测显示纳米粒子能够通过吞噬或扩散作用进入细胞内部,与细胞内部物质起作用,荧光光谱分析显示在近紫外光辐照下,5-ALA与TiO2之间存在能量的转移。 (5)相衬显微镜对PDT过程中细胞形态学变化无损观察结果显示药物能与细胞膜发生作用,最终诱导细胞凋亡;扫描电镜对细胞表面超微结构观察显示正常细胞饱和圆润,表面明亮光滑,PDT作用后的细胞褶皱变形,局部破裂,出现凋亡特征。 (6)联合作用分析结合得到的实验数据表明,TiO2的存在能够提高5-ALA对HL60细胞的灭活效率,5-ALA与TiO2在PDT过程中具备良好的协同作用,证实5-ALA/TiO2可作为一种复合光敏剂应用于体外PDT灭活HL60细胞。