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第一部分、KIF11(Kinesin superfamily proteins11)是一种微管驱动蛋白,属于KIF5家族中的一员。KIF11蛋白是细胞内与物质运输、细胞有丝分裂相关的重要蛋白。KIF11不但调节神经细胞的迁移速率和方向性,而且对神经细胞生长锥的生长和应对环境变化起着重要的作用。ZBP1(Zipcode binding protein1)属于VICKZ家族成员,是一种mRNA结合蛋白,在mRNA基因转录后表达调控过程中均发挥着非常重要的作用。有研究表明,ZBP1可以与mRNA结合,从而影响细胞的极性和浸润能力。ZBP1的KH34基序与β-actin mRNA结合,形成ZBP1-mRNA复合物,我们前期研究表明,ZBP1-mRNA复合物通过ZBP1的RRM12基序与KIF11的尾部的结合来调控β-actin的表达。目前虽然发现KIF11与ZBP1共同作用来调节物质的运输,但是它们的结合对神经细胞内的物质运输有哪些影响目前尚未有文献报道。由于神经元细胞不能连续生长,我们选用了可以在dbc AMP刺激下分化出轴突的类神经细胞NG108-15。我们利用显性负原理,使ZBP1的RRM12片段整合到细胞基因组DNA,RRM12片段与内源型KIF11竞争性结合,从而干扰了KIF11与正常ZBP1的结合;同时我们用shRNA敲降技术降低内源性的KIF11的表达,从而减少了KIF11与ZBP1的结合。 首先我们构建了稳定表达的细胞系:对照组、敲除KIF11、过表达ZBP1与KIF11结合域 RRM12基序。利用慢病毒感染的方法,使NG108-15细胞基因组整合了Phage-UBC-GIR、Phage-UBC-RRM12-cherry、pGIPZ-sh-KIF11三个质粒,通过分选型流式细胞仪筛选阳性细胞扩大培养,构建细胞系。利用Western Blot的方法鉴定sh-kdKIF11组的敲降效果。 接着用NG108-15细胞进行分化实验,细胞爬片后进行固定、染色、拍照。统计细胞的轴突生长情况,包括轴突长度和数量。我们发现在实验组中,NG108-15细胞的轴突长度比对照组长,同时实验组的轴突数量减少,这说明KIF11与ZBP1的结合对NG108-15细胞轴突生长有影响。另外我们证明了在NG108-15细胞轴突上存在KIF11与ZBP1的共定位。 第二部分、mRNA转录后的翻译调控是维持细胞极性、神经元的生长的一种重要的调控方式。因此mRNA的转录翻译有着重要的意义。芽殖酵母作为一种单细胞真核模式生物,方便我们进行mRNA的翻译调控研究。在芽殖酵母中,ASH1 mRNA在子细胞芽尖的不对称表达决定了细胞的交配类型的转换。目前ASH1 mRNA的翻译定位机制已经充分的阐明,但是其在定位后的翻译降解机制尚未了解。有研究表明,在酵母内存在一种转化处理小体(P-body),这种转化处理小体内存在着大量的mRNA水解酶类,同时P-body也有着储存mRNA的功能。而P-body的组装也受Dhh1蛋白的调控。在ASH1mRNA定位到子细胞芽尖的过程中,Puf6作为翻译抑制因子与ASH1mRNA结合, 因此我们用同源重组的方法构建了野生型芽殖酵母的DHH1缺失菌株,以及双缺失PUF6和DHH1菌株,用Western Blot的方法检测基因缺失型菌株Ash1蛋白的表达水平变化,用RT-PCR的方法检测ASH1在mRNA水平变化。我们发现双缺失菌株中Ash1蛋白的表达水平比单缺失菌株高,单缺失菌株又高于野生型菌株。而在mRNA水平,野生型最低,双缺失次之,单缺失表达量最高。