论文部分内容阅读
本文以广东省稻瘟菌(Magnaporthe grisea)优势小种ZC13(菌株97-151a)和抗稻瘟病水稻(Oryza sativa)品系C101A51(含pi-2抗性基因)为材料,对稻瘟菌49kDa、102kDa糖蛋白激发子的分离纯化过程进行了优化,为蛋白结合试验提供材料;成功提取了高纯度的水稻叶片细胞质膜;通过利用地高辛标记的激发子做为探针进行亲和印迹的方法,在质膜上找到了49kDa糖蛋白激发子的结合蛋白;并通过质谱技术对该结合蛋白进行分析鉴定。
为了满足受体研究的需要,获得较多的激发子,以本研究室激发子的纯化路线为参考,利用层析与凝胶电泳联用的方法对稻瘟菌糖蛋白激发子的分离纯化过程进行了优化,使原来需要通过两个层析过程分别得到的两个糖蛋白激发子在一个层析一电泳过程中同时纯化获得。另外,激发子受体研究需要高质量的质膜材料。利用匀浆—差速离心的方法,提取水稻叶片细胞粗膜微粒体;水双相分配法分离纯化粗膜微粒体中的质膜成分。通过H<+>-ATPase对特异性抑制剂敏感性测定,分析质膜纯度。结果表明:
1、粗膜制剂富含细胞粗膜微粒体;
2、分离纯化叶片细胞质膜最适的水双相体系聚合物浓度为6.2%;
3、三次水双相分配对得到高纯度质膜是必要的;
4、特异性抑制剂对经三次水双相分配所得质膜H<+>-ATPase活性的影响分别为:Na<,3>VO<,4>对H<+>-ATPase活性的抑制率高达79.07%,KNO<,3>对H<+>-ATPase抑制率为3.17%,NaN<,3>对H<+>-ATPase抑制率为1.22%。另外,质膜微囊方向性和封闭性测定实验表明84.37%的膜微囊为正向型质膜微囊。以上结果表明:经6.2%的水双相体系三次分配可获得纯度较高、封闭性好的水稻叶片细胞质膜。
将激发子经SDS-PAGE后电转移至PVDF,最适电转移条件及电转缓冲液成分筛选试验结果表明,最适电转移条件为:在200V恒压冰水浴电转一小时,最适电转移缓冲液成分为:25mmol/L Tris碱;192mmol/L 甘氨酸;10%甲醇;0.01%SDS。将成功转移的激发子分别与地高辛标记的粗膜、质膜进行亲和印迹,结果表明:粗膜与质膜均可与49kDa糖蛋白激发子产生结合信号。另外,将粗膜和质膜首先进行常规PAGE再电转移至PVDF,然后与地高辛标记的激发子进行亲和印迹,结果发现:粗膜与质膜均可与49kDa糖蛋白激发子产生同一的结合信号。以上表明:在水稻叶片质膜上存在稻瘟菌49kDa糖蛋白激发子的结合蛋白。将质膜上的结合蛋白切胶并进行质谱分析鉴定,用SEQtJEST 进行数据处理,再经NCBI Oryza sativa蛋白数据库检索,结果表明:结合蛋白与unname proteinproduct CAA34004.1蛋白匹配的唯一肽段数为40,蛋白鉴定覆盖率达49.69%。
进一步对蛋白CAA34004.1进行生物信息学分析,结果发现蛋白CAA34004.1由477个氨基酸组成,分子式为C<,2360>H<,3647>N<,653>O<,690>S<,21>,分子量为52881.1,等电点为6.22。CAA34004.1跨膜三级结构有两种可能性:一种是含有两个跨膜螺旋结构,且N端在外,这两个跨膜螺旋分别为111~130氨基酸区段从外到内的跨膜螺旋及359~382氨基酸区段从内到外的跨膜螺旋;另一种可能为只存在一个359~382氨基酸区段从内到外的跨膜螺旋。在CAA34004.1的这两种可能的三级结构中均存在多个胞内丝/苏氨酸磷酸化位点。因此推断蛋白CAA34004.1可能具有膜受体蛋白功能。此外,通过PROSITE进行蛋白质功能位点预测,在196~204氨基酸区段存在一个二磷酸脱氢酶功能位点。