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气相色谱法是一种以气体作为流动相的色谱方法,具有分离效率高,样品用量少,分析速度快和操作流程简单等优点。随着高效能色谱柱和高灵敏检测器的出现,气相色谱法已广泛应用于农业、工业、食品、卫生、医药、环境等领域,常用于大多数有机物的检测分析。采用气相色谱法检测沸点高、极性大或热稳定性差的物质时,往往需要通过衍生的方法将其转化为适于分析的衍生物。常用的气相衍生试剂包括硅烷化试剂、烷基化试剂、酰基化试剂等。乳酸和丙酮酸是葡萄糖代谢的重要产物,两者在乳酸脱氢酶的催化下进行可逆性转化,以维持机体的稳定。在细胞水平上,乳酸是葡萄糖无氧呼吸的最终代谢产物,可反映细胞的线粒体功能和糖酵解状态,还可作为癌细胞的能量来源。在临床上,乳酸和丙酮酸是各类疾病筛选有效的指标。测定机体乳酸和丙酮酸的含量具有重要的生理和病理意义,本实验建立了衍生气相色谱的方法应用于生物样本中乳酸和丙酮酸的检测。主要内容如下:第一部分衍生气相色谱法检测细胞培养基中的乳酸目的:建立衍生气相色谱法检测细胞培养基中乳酸含量的新方法,并用于定量暴露于不同剂量邻苯二甲酸-2-乙基己基酯的心肌细胞和不同培养时间的肺癌细胞的乳酸分泌量。方法:建立两种细胞模型后,收集细胞培养基并用去离子水稀释,氯甲酸乙酯作为衍生试剂,在优化的色谱和衍生条件下,通过气相色谱-氢火焰离子化检测器定量分析培养基中的乳酸。结果:在最佳条件下,乳酸在0.100~5.00 mmol/L的范围内线性关系良好,回归方程为Y=93.191+850.95X,相关系数(r)为0.9997。该方法的检出限(LOD)为0.67μmol/L(S/N=3),定量限(LOQ)为2.20μmol/L(S/N=10)。细胞培养基中三种不同浓度的平均加标回收率为99.60%~100.76%,精密度RSD<5.49%。结论:本实验建立了一种检测细胞培养基中乳酸含量的衍生气相色谱方法。该方法简便、快速、灵敏,可用于定量生物样品中的乳酸。第二部分衍生化USAEME-GC同时检测动物组织中的乳酸和丙酮酸目的:将液相微萃取和气相衍生方法相结合,建立衍生超声乳化液相微萃取-气相色谱法(USAEME-GC)同时检测动物组织中的乳酸和丙酮酸,并用于定量小鼠缺氧模型心脏组织中的乳酸和丙酮酸。方法:建立动物缺氧模型后,心脏组织用1.2%的高氯酸进行匀浆,甲氧胺盐酸盐和氯甲酸异丁酯作为衍生试剂,在优化的USAEME-GC条件下,用气相色谱-氢火焰离子化检测器对心脏组织中的乳酸和丙酮酸进行定量分析。结果:在最佳条件下,乳酸和丙酮酸分别在50.0~1.00×10~3μmol/L、1.00~100.0μmol/L的范围内线性关系良好,回归方程分别为Y=199.04+3.7173 X,r=0.9999;Y=2.3100 X-1.1838,r=0.9999。乳酸检出限为0.12μmol/L,定量限为0.41μmol/L;丙酮酸检出限为0.29μmol/L,定量限为0.97μmol/L。两种分析物的加标回收率为93.60%~102.80%,精密度小于6.20%。结论:本实验建立了一种同时检测心脏组织中乳酸丙酮酸含量的原位衍生超声乳化液相微萃取-气相色谱方法。该方法简单、快速、灵敏,为生物样品中乳酸和丙酮酸的同时检测提供了定量方法以及为线粒体疾病的诊断提供了技术辅助支持。