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研究背景随着21世纪的到来,人口老龄化问题已经成为全球性的普遍问题。我国是人口大国,是世界上老年人口比例最高的国家,老龄化问题明显[1]。另一方面,衰老是引起大多数慢性疾病的主要危险因素。目前从基础、临床前和临床研究在多个体内外模型上验证了这一观点[2]。因此,研究和阐明衰老相关疾病和功能障碍的病理机制,延缓人类衰老,提高生存质量,具有重要的现实意义和社会意义[3][4]。近年来,人类在衰老相关疾病领域的研究已经取得了较大进展,衰老虽然是人类生命过程中不可抗拒的自然规律,但通过改善身体机能状态提高人类的生存质量和寿命,延缓衰老也是可以实现的。二至丸由女贞子和墨旱莲两味中药组成,为平补肝肾的中医代表方剂。研究证明二至丸中具有红景天苷、特女贞苷、旱莲苷A、芹菜素等活性成分,这些活性成分具有抗氧化、抗癌、抗纤维化病变,但具体药效机制作用靶点及要动学过程还不太清楚。课题通过现代药理学、分子生物学等实验技术及方法,采用D-半乳糖致衰老大鼠模型模拟人类衰老时的病理变化,旨在研究二至丸延缓衰老的药效作用并探讨其作用机制。通过本项课题的研究,为运用滋补肝肾延缓衰老提供实验依据,并为其临床运用提供支持,同时拓展了中医药防治衰老的研究思路,为研制具有抗衰老活性的药物奠定基础。研究方法1.SD大鼠,雄性,42只,随机分为空白对照组（生理盐水,1ml/100g）,模型对照组（生理盐水,1ml/100g）,尼莫地平阳性组（12.26 mg/kg/d,1ml/100g）,二至丸高、中、低剂量组（7.412 g/kg/d、3.706 g/kg/d、1.853 g/kg/d,1ml/100g）,每组7只,颈背部连续注射D-半乳糖40天（0.125 g/kg/d）,以D-半乳糖致亚急性衰老模型,同时连续给药40天,第41天开始连续行5天水迷宫实验。第46天,动物麻醉处死摘取脑组织,苏木素-伊红（HE）染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察大脑的病理学变化;电镜观察大脑神经元形态和神经元内线粒体结构的变化;取10%的脑组织匀浆,测定组织丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）,脑组织线粒体中ROS,ATP和线粒体膜电位等指标的变化;Western Blot测定脑组织海马中PGC-1α、Foxo3a、SRIT1、P53、Caspase3、Bcl2、Bax等蛋白表达;实时荧光法定量PCR方法检测PGC-1α、Foxo3a、SRIT1、P53、Caspase3、Bcl2、Bax m RNA的表达。2.SD大鼠,雄性,30只适应性喂养7d,随机分成高,中,低3个剂量组,每组10只,各组分别给药（7.412 g/kg/d、3.706 g/kg/d、1.853 g/kg/d,1ml/100g）;分别于给药后第0min,5min,10min,20min,30min,60min和2h,4h,8h,12h,24h自眼底静脉取血,每次0.5m L,取得的血液样本置肝素化的离心管中,立即离心处理（3500r Pm,10min）,吸取上清,用UPLC-Q-TOF-MS分别测定二至丸中红景天苷、特女贞苷、旱莲苷A、芹菜素在大鼠血清中含量,DASver2.1.1软件计算其药物代谢动力学参数。研究结果（1）二至丸能显著降低D-半乳糖致衰老大鼠海马组织匀浆中丙二醛（MDA）的含量（P<0.01）,升高了超氧化物歧化酶（SOD）的活力（P<0.01）;（2）显著增强海马中线粒体中三磷酸腺苷（ATP）的含量（P<0.01）,降低活性氧（ROS）水平（P<0.01）;（3）病理检查结果显示:二至丸能明显减轻脑组织海马神经元、小胶质细胞的变性坏死及明显减轻大鼠海马神经损伤,减少线粒体的肿胀坏死。（4）空间定位航行试验中二至丸各剂量组大鼠的逃避潜伏期比模型对照组大鼠的逃进潜伏期短,统计学比较有显著差异（P<0.01）,空间探索试脸中二至丸各剂量组大鼠平台穿越次数比模型对照组的平台穿越次数多,统计学比较有显著差异（P<0.05）;（5）二至丸高、中、低剂量组可以明显升高线粒体的膜电位（P<0.01）;（6）二至丸可以明显降低大鼠脑组织海马中P53、Caspase3基因和蛋白的表达（P<0.01）,同时升高sirt1、PGC-1α、Foxo3a、Bcl2/Bax蛋白的表达及m RNA含量（P<0.01）;（7）建立了UPLC-Q-TOF-MS法测定各个时间点血浆中红景天苷、特女贞苷、旱莲苷A、芹菜素含量的方法,具有灵敏度高、快速、简便、准确,重现性好等特点。大鼠分别单次口服给药高、中、低剂量的二至丸后,测定的血浆中红景天苷、特女贞苷、旱莲苷A、芹菜素的含量并通过DASver2.1.1计算得出参数值,药代动力学研究的结果提示,二至丸中主要活性成分旱莲苷A在大鼠体内药代动力学特征符合口服给药一房室模型,特女贞苷、红景天苷及芹菜素药代动力学特征符合口服给药二房室模型药代动力学过程。结论（1）二至丸高、中、低各剂量组均可不同程度地减轻D-半乳糖所致的氧化应激性损伤,其机制主要是通过清除体内过多的氧自由基;（2）二至丸高、中、低各剂量组均可不同程度地减轻D-半乳糖所致的细胞凋亡和线粒体结构和功能的损伤,主要是通过调控SRIT1,PGC-1α、Foxo3α、P53、Caspase3、Bcl2、Bax等基因和蛋白的表达,改善受损线粒体的结构和功能,减少细胞的凋亡;（3）二至丸高、中、低各剂量组均可不同程度地减轻D-半乳糖所致脑组织海马神经元、小胶质细胞的变性坏死及大鼠海马神经损伤,主要是通过改善线粒体结构功能,抗氧化反应来减少炎症病变;（4）二至丸高、中、低各剂量组均可升高线粒体跨膜电位,Rh123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针,容易与活性的线粒体聚集,当线粒体受损时,线粒体跨膜电位下降,细胞线粒体使Rh123结合的能力也下降,重新释放Rh123,荧光强度增强;（5）药代动力学研究的结果提示,二至丸中主要活性成分旱莲苷A在大鼠体内药代动力学特征符合口服给药一房室模型,特女贞苷、红景天苷及芹菜素药代动力学特征符合口服给药二房室模型药代动力学过程。