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第一章、装载VEGF纳米颗粒修饰去细胞血管基质的构建
目的:探讨肝素/壳聚糖为载体,VEGF为药物的纳米载药颗粒制备工艺、工艺参数及颗粒性能。在此基础上探讨纳米颗粒与去细胞牛颈静脉的结合方式,评估其作为组织工程生物材料的可行性。
方法:离子交联法制备肝素/壳聚糖纳米颗粒。根据制备条件分成Ⅰ-Ⅴ共5组(n=6),调整壳聚糖分子量,壳聚糖溶液pH值,壳聚糖、肝素浓度及配比,选用不同分子量肝素制备纳米颗粒,研究其结构和缓释性能。
采用物理自组装和化学共价交联将纳米颗粒结合至牛颈静脉。物理自组装时间取2小时、4小时、12小时、24小时;化学交联剂EDC取0 mmol/L、5 mmol/L、10mmol/L、20mmol/L四种浓度。扫描电镜和体外流体剪切力实验评价纳米颗粒稳定程度。将载纳米颗粒牛颈静脉浸入浓度为50ng、250ng/mL VEGF溶液中孵育过夜,ELISA定量分析VEGF缓释性能。
结果:离子交联法制备肝素/壳聚糖纳米颗粒的最佳粒径:67nm-92nm,PDI:0.08-0.121,Zata电位:+28mv~+30mv。物理自组装及化学共价交联使纳米颗粒与牛颈静脉牢固结合,VEGF在纳米颗粒修饰牛颈静脉表面载药量可达197ng/mm2,30日VEGF累计缓释量<42.17%。
结论:离子交联法成功构建装载VEGF肝素/壳聚糖纳米颗粒。物理自组装及化学交联能够实现纳米颗粒与去细胞血管基质牢固结合。VEGF可在纳米颗粒修饰去细胞基质表面大量载药并长期缓释。
第二章、装载VEGF纳米颗粒修饰去细胞血管基质体外及体内再生研究
目的:体外试验评价装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉生物相容性及细胞粘附增殖能力。大鼠皮下包埋动物模型评价装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉体内多种细胞浸润和细胞外基质再生动态变化,并了解其变化机制。
方法:体外性能研究:通过溶血率,血常规各项指标变化,APTT及血小板粘附评价去细胞光氧化牛颈静脉及装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉体外生物相容性。采用细胞形态观察法和MTT比色法评价各组内皮细胞体外粘附及增殖能力。
体内性能研究:建立大鼠皮下包埋动物模型,植入去细胞光氧化牛颈静脉及装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉血管片,分别于4周、8周取出标本,大体形态观察;组织化学和免疫组织化学染色观察细胞浸润、微血管形成、细胞外基质主要成分再生情况。
结果:
1、体外血液相容性试验:去细胞光氧化牛颈静脉(SF-DP)、装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉(SF-NP-VEGF)、物理自组装载VEGF纳米颗粒修饰牛颈静脉(SF-NP-VEGF NO EDC)各组溶血率分别为1.998%、1.277%、1.401%;血常规计数中SF-DP血小板数目低于其他组(P<0.05)。内皮细胞种植试验结果:形态法观察各组细胞毒性分级均为0-1级。SF-NP-50ng VEGF,SF-NP-250ng VEGF表面细胞增殖能力强,具备血管发生倾向。MTT实验显示SF-NP-50ngVEGF,SF-NP-250ng VEGF表面细胞活力显著强于SF-DP表面细胞活力(P<0.01)。
2.体内再生研究显示:大鼠皮下包埋4周时,SF-DP少量细胞在外膜区域浸润,无明显微血管断面及细胞外基质产生;SF-NP-250ng VEGF可见多种细胞浸润,深度达血管壁1/4厚度,可见散在排布微血管断面及均匀细胞外基质产生。大鼠皮下包埋8周时,SF-DP少量细胞浸润,血管壁外侧1/4可见微血管断面及少量细胞外基质生成;SF-NP-250ng VEGF细胞浸润达血管壁厚度2/3,大量新生毛细血管及细胞外基质均匀分布。
结论:
1、装载VEGF纳米颗粒修饰去细胞血管基质具有良好生物相容性和极低的细胞毒性。
2、装载VEGF纳米颗粒修饰去细胞基质能够实现体内细胞浸润及细胞外基质再生,成为具备再生能力的组织工程材料。